Mol Cell 背靠背 | mRNA 代谢动态全解析

撰文 | 伊凯
责编 | 兮
在现代分子生物学中，具有高维度、动态化特征的基因表达谱被广泛认为是连接生物体遗传特征、外界环境刺激与表现型之间的最重要的桥梁，也是标定细胞状态的最终指征。而RNA高通量测序技术和蛋白组质谱技术的成熟也使得研究人员在各类自然或人为的生物学环境中对基因表达进行精准测量成为了日常。不过，基因表达这一概念背后暗含的多层级、多角度的复杂调控机制所带来的不确定性却往往受到了忽视。一个重要的例子是，绝大多数情形下的RNA-seq实验所测得的由转录本片段数所代表的基因表达量实际上仅是基因转录、RNA剪接、RNA降解等一系列胞内化学反应达到稳态时的RNA分子总丰度。这一度量值显然极大地丢失了RNA代谢过程的动态变化信息，包括RNA转录速率、RNA加尾效率和RNA降解速率等 （尽管也有一些计算方法可根据外显子、内含子转录读本比例间接推测RNA稳定性等，但其可靠性和稳定性并未得到广泛承认【1,2】） ，而对于相当一部分生物学问题而言，后者可能是更为重要的测度目标。
在描绘RNA分子代谢的动态变化从而定量RNA降解方面，主流实验方法包括小分子抑制剂介导的全局转录停滞和核苷酸类似物标记暨生物素捕获两类【3】。后者凭借对细胞生理状态扰动较小、RNA定量精度较高等优势成为普遍被采用与RNA-seq相结合的方法。不过，其在提供关于RNA稳定性/降解速率的信息之外，无法对控制这一产出的机制做出描述。正是因为实验和分析方法上的限制，研究者对RNA代谢过程和调控因素的研究尚局限在个别案例中，缺乏对全局图景的描绘。
近日，来自麻省理工学院Whitehead研究所的David Bartel实验室在Molecular Cell上发表了两篇背靠背的研究论文，以公认为调控RNA稳定性最为重要的两个机制——mRNA脱腺苷化 （deadenylation） 和miRNA结合为切入点，在全转录组水平定量解析了胞质mRNA从转录合成到降解过程中的各项代谢特征和驱动这一图景形成的核心力。

在第一项研究中，作者主要结合了2014年发表的测量RNA加尾点和尾长的PAL-seq方法【4】的改进版和5EU介导的RNA标记【5】两种方法，在不同时间点进行RNA-seq，对全基因组RNA合成到降解过程中的polyA尾长分布、去尾速率和半衰期等代谢特征做了详细描绘。同时，作者还基于这一丰富的数据集拟合出一个简单的由转录、去尾、降解三步骤构成的生化模型。这一动态分析方法帮助作者发掘出了多个在稳态RNA测序实验中并不存在甚至结论相反的有趣现象，例如：一、稳态RNA转录本的尾长与其半衰期几乎没有相关性 （相关系数绝对值低至0.02） ，相反，RNA转录本向稳态迁移过程中的去尾速率却与其半衰期呈显著负相关 （相关系数高达-0.83） ；二、与前人在缺乏证据的情况下的猜测相反，不同基因转录出的新生RNA的polyA尾长差异相当显著，值域可达到近一百个核苷酸；三、不同基因的RNA去尾速率差异可达1000倍以上，上下界限分别为30核苷酸每分钟和1.8核苷酸每小时；四、大部分mRNA直到去尾至25个核苷酸以下时才会出现显著降解，这与通常认为的指数降解模型十分不同。

这些观察虽然仍然停留在描述性层面，缺乏分子机制的探索和验证，但无疑仍然透露出诸多关于mRNA代谢这个大命题的一些普遍性结论，例如证实了去尾过程是mRNA降解的核心动力并定量化了二者间的关联。另外，对于为何mRNA短尾能够起始降解过程，作者也给出了机制上的推测，即PABPC蛋白无法结合在过短的mRNA尾端，因而导致降解复合体不受排斥地工作。

在第二项研究中，作者基于上述对mRNA代谢动态的全面性描述所得出的一系列观察，试图从miRNA结合调控的层面找到一定的分子机制基础。这一研究方向的合理之处在于人们已知miRNA及其介导的RNA沉默复合体与mRNA去尾复合体CCR4-NOT等之间具有直接功能性关联，且miRNA的过表达的确能造成mRNA去尾加速和稳定性降低【6】。但另一方面，miRNA对mRNA的调控在mRNA的跨时间动态代谢过程中具体表现形式是怎样的，是否与稳态下呈现截然不同的特征，却并不清楚。而作者在第一项研究中所开发的PAL-seq和5EU标记的RNA测序平台即是能够解决这一问题的极佳手段。
为了观察miRNA对于稳态mRNA的polyA尾是否存在调控效应，作者在诱导表达几类miRNA及对照的细胞系中分别利用一般RNA-seq和PAL-seq测量了RNA转录本的丰度及尾长。结果发现，miRNA-seq活化的确能够显著降低靶标mRNA的表达量，但却几乎不对稳态下的尾长产生任何影响。与此相反，当作者在PAL-seq/5EU跨时间点RNA测序框架下重复上述测量时，发现miRNA的活化不仅使得新生mRNA的去尾加快，且这一效应呈现先强后衰弱的特征，至接近稳态时几乎消失。因此，miRNA结合与mRNA去尾之间的联系往往是发生在形成稳态之前的转录本代谢过程中的。
然而，上述观察却带来了一个难以解释的悖论，即如果miRNA活化导致更多mRNA靶标快速去尾，为什么作者在RNA-seq实验中却未观察到由这部分短尾mRNA堆积带来的整体尾长分布的左移呢？显然，一个合理的解释是这部分快速形成的短尾mRNA在达到尾长阈值后被快速的降解掉了，因此未对整体稳态mRNA的尾长分布造成显著影响。为了证实这一假说，作者利用第一项研究中所构建的生化动力学模型，将其中的去尾速率变量和短尾mRNA降解速率变量之间的三种搭配可能 （即10，01，11） 作为检测miRNA活化效应的介质。亦即，哪一种修改后的模型更符合实际观测数据，则对应的假说具有更高的置信度。作者发现，当同时调高mRNA去尾速率和短尾mRNA降解速率这两个变量时，模型所预测的RNA丰度变化和尾长变化趋势更贴合实际情况。相反，另外两种模型则均在尾长变化方面显著偏离了实验观测。故，无论是从逻辑推理出发，还是以实验观测和模型预测的贴合度出发，miRNA既加快mRNA去尾，也促进去尾后快速降解的假说都是成立的。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.12.005https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.12.004
制版人：珂

参考文献

1. Gaidatzis, D., Burger, L., Florescu, M. & Stadler, M. B. Analysis of intronic and exonic reads in RNA-seq data characterizes transcriptional and post-transcriptional regulation.Nat. Biotechnol.33, 722–729 (2015). 2. Alkallas, R., Fish, L., Goodarzi, H. & Najafabadi, H. S. Inference of RNA decay rate from transcriptional profiling highlights the regulatory programs of Alzheimer’s disease.Nat. Commun.8, 1–11 (2017). 3. Tani, H. & Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells: Historical perspective and recent advantages based on modified nucleotide labeling.RNA Biol.9, 1233–1238 (2012). 4. Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H. & Bartel, D. P. Poly(A)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control.Nature(2014) doi:10.1038/nature13007. 5. Jao, C. Y. & Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(2008) doi:10.1073/pnas.0808480105. 6. Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs.Cell173, 20–51 (2018).