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关键词/Nanopore测序 微生物
来源/元码基因 编辑/基因慧
元码基因科学团队采用三代测序技术，快速至45分钟就可获得宫颈处前十种主要微生物与HPV的信息。研究成果已于北京时间12月19日在Scientific reports(IF=4.122)以题目“Simultaneous detection and comprehensive analysis of HPV and microbiome status of a cervical liquid-based cytology sample using Nanopore MinION sequencing”刊出（点击文末“阅读原文”可见）。
人体内环境是复杂的大自然中一个相对独立的小环境。在这个小环境里面有大量的微生物与我们生活在一起，其中有益生菌保护我们，也可能有病原菌伤害我们。体内微生物菌群的变化可能引起某种疾病，同时身体状态也可能反过来作用于菌群。人类乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是引起宫颈癌的主要病原生物，同时宫颈癌的发展可能与宫颈处微生物群落结构变化有关。
然而，市面上目前还没有一种可以同时快速检测HPV病毒和其他微生物的方法。因此，我们需要更好的工具对HPV等微生物进行区分鉴别分析。
图1：HPV病毒（来源/互联网）
针对这个问题，元码基因科学团队采用多重 PCR技术和Nanopore测序，只需花费 45分钟，就可以同时得到宫颈处前十种主要微生物与 HPV的信息。具体的方法，采用多重 PCR技术扩增 HPV E6&E7 区域以及 16s 全长，并对扩增产物使用Nanopore进行测序。
经验证，其分析结果与 Illumina 测序平台检测结果一致，但花费的时间大大缩短。
图2：该项研究成果已在Scientific reports ( IF=4.122) 上刊出（来源/元码基因，下同）
该项研究成果已于北京时间12月19日在Scientific reports ( IF=4.122) 上刊出，是目前第一篇用ONT单分子测序平台同时快速检测HPV感染和宫颈微生物组的文章。
一、微生物群落结构
【具体方法】元码基因团队分别采用Nanopore和Illumina测序平台对微生物进行16s扩增子测序。
■Nanopore测序平台测序多重PCR产物，引物分别为16s全长与HPV E6&E7 区。
■Illumina 测序平台
只检测16s V4区产物。
■比对和注释
Nanopore测序数据先与HPV基因组数据库比对，得到的HPV信息作为分型鉴定的辅助依据。对于没有比对上HPV的测序数据，继续进行微生物物种注释流程。
16s 分析结果显示，Nanopore测序平台检测到丰度前十种微生物在不同分类水平与Illumina测序平台一致。低丰度的rare genus种类数量，Illumina平台检测到的比Nanopore平台多，其原因可能因为Illumina平台测序深度远大于Nanopore平台。
图3：不同分类水平的物种注释（a，门水平；b，纲水平；c，目水平；d，科水平；e，属水平）
此前已有文献报道，同一批次测序数据如使用不同的分析方法则会产生不同的结果。这其中，比对方法与使用的数据库有很大的影响。基于此，采用了不同的方法与数据库分别对Nanopore测序样品进行分析。
■采用不同方法与数据库对Nanopore测序数据进行分析：
1）传统方法 QIIME + greengenes 数据库；
2）Nanopore测序常用比对软件 LAST + greengenes 数据库；
3）Nanopore测序常用比对软件 LAST + NCBI 16s 数据库。
图4a：不同分析方法的比较图；4b 高丰度物种的亲缘关系
文氏图（图4a）为三种方法在属水平上物种注释结果的比较，三种颜色的圈分别代表三种方法，中间的10表示三种方法检测结果共有10个属，其正好是丰度前十的微生物，说明 Nanopore 16s 全长测序结果具有很好的 robust 性。
NCBI 数据库相比greengenes 数据库具有一大优势，它可以注释到种水平，在后续临床应用中可以为医生提供更多的信息。系统发育树（图4b）为注释到种水平的微生物以及进化关系，包含了丰度前十的十个属。
二、快速检测
按照不同的百分比随机抽取Nanopore reads，以此模拟不同测序时间的注释结果，每个百分比分别随机抽取十次。
■数据抽取之后的分析结果（表1）
第一列：抽取reads的百分数；
第二列：测序的时间；
第三列：抽取的reads数；
第四列：抽取的reads中16s平均reads数；
第五列：抽取的reads 中 HPV平均reads数；
第六列：微生物丰度前十的平均reads数；
第七列：支持reads大于4时检测到全部丰度前十的次数；
第八列：每次随机抽取后与全部测序reads群落结构的相似程度。
从中可以看出，只需测序45分钟就可以得到完整的微生物群落结构以及HPV信息，与MiSeq PE250大于24小时测序时间相比大大缩短。
表1：随机抽取测序数据的分析比较
三、元码基因依托技术平台优势
这项技术具有实验步骤简单、易于操作且花费时间短的优势。应用到临床检测时，可以大大减少患者等候结果的时间。
如果检测结果与自动化报告系统联用，在检测结果得出的同时，可以给医生提供相关微生物的信息，辅助医生针对每个患者个体制定个性化治疗方案。
同时，Nanopore的flowcell可以短时间内不同批次重复使用，无需等待大量患者样品就可以测序分析。这个优势能够大大降低检测成本。
因此，元码基因通过同时检测HPV病毒感染和宫颈微生物组（感染或者菌群失衡）的方式，解决了疑似感染者对快速检测的需求，把单分子测序的能力发挥了出来。
展望未来，这项技术的普及就可以让更多的患者受益于“高质量、低价格、快时间”的个性化诊疗。
参考资料：
[1] Rebolj, M. et al. Primary cervical screening with high risk human papillomavirus testing: observational study. BMJ 364, l240 (2019).
[2] Gao, W., Weng, J., Gao, Y. & Chen, X. Comparison of the vaginal microbiota diversity of women with and without human papillomavirus infection: a cross-sectional study. Bmc Infectious Diseases 13, 271–271 (2013).
[3] Arokiyaraj, S., Seo, S. S., Kwon, M., Lee, J. K. & Kim, M. K. Association of cervical microbial community with persistence, clearance and negativity of Human Papillomavirus in Korean women: a longitudinal study. Scientific reports 8 (2018).
（封面图来源/元码基因）
关于元码基因
元码基因是一家集精准医疗新技术研发、产品转化和基因检测服务为一体的高新技术企业。聚焦于搭建临床肿瘤精准医疗平台，致力于将先进的基因组学技术应用于临床实践，为用户提供更可靠的精准医疗解决方案。依托完整的技术平台，在肿瘤领域成功推出济康、济克、济安系列肿瘤产品线。涵盖肿瘤早筛早诊、精准用药和实时监控的全时段管理，最大限度地满足不同阶段肿瘤患者的需求。此外，自主研发出UCap、DeCap、TCap、PCap核心技术，以及“10K”系列液体活检产品，实现肿瘤无创检测，并率先提出“四定液体活检”（“定量”、“定性”、“定位”、“定序”）的新一代液体活检理念，为临床无创肿瘤基因检测开启了全新模式。
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