双生病毒，是一类世界范围内广泛存在的单链环状DNA病毒，在全球小麦、玉米、木薯、番茄和棉花等重要的粮食和经济作物上造成毁灭性危害，已成为世界上记录最早、种类最多的植物病毒。
开发具有双生病毒抗性的作物品种，使解决病害、提高作物产量、保证粮食安全的重要手段，然而在这方面始终未能取得突破。
最近，有研究将CRISPR/Cas9基因编辑系统转移到植物中，以靶向双生病毒，并期望赋予植物对双生病毒的免疫力。
近日，苏黎世联邦理工大学的研究人员在 Genome Biology 杂志发表了题为： Linking CRISPR-Cas9 interference in cassava to the evolution of editing-resistant geminiviruses 的研究论文。
研究人员希望通过CRISPR/Cas9技术解决主要粮食作物非洲木薯中广泛存在的非洲木薯花叶病毒（ACMV）感染问题，非洲木薯花叶病毒是双生病毒的一种，而非洲木薯是非洲最重要的粮食作物。
通过CRISPR/Cas9靶向非洲木薯花叶病毒（ACMV），结果表明，CRISPR/Cas9转基因植物未能获得有效的双生病毒抗性，而且CRISPR/Cas9的使用导致出现了一种新的保守突变病毒，其不能被CRISPR/Cas9切割。
该研究表明，CRISPR/Cas9的应用反而加快了双生病毒的进化，可能会带来重大生物安全风险。
因此，应严格审核、谨慎对待CRISPR/Cas9进行植物病毒抗性的应用，以避免诱导进化出抗性病毒。
双生病毒在全球小麦、玉米、木薯、番茄和棉花等重要的粮食和经济作物上造成毁灭性危害，已成为世界上记录最早、种类最多的植物病毒。然而，在开发对这些高度多样化的DNA病毒具有抗性的作物品种方面始终没有取得有效进展。
源自细菌和古菌的CRISPR/Cas9系统，本是细菌和古菌对付病毒入侵的防御工具，因此，使用CRISPR/Cas9系统靶向双生病毒，赋予植物对双生病毒的免疫力，是一个很有希望的研究思路。
在这项研究中，研究人员选取了被双生病毒感染问题困扰已久的非洲木薯，希望获得抗病毒的非洲木薯。
非洲木薯产量巨大、种植方便，几乎不用管就能获得好收成，因此虽然不好吃，但逐渐成为非洲最主要的粮食作用。也成为解决非洲饥荒问题的法宝。
感染木薯花叶病毒的木薯
使用CRISPR/Cas9技术构建抗病毒非洲木薯的策略
然而，这项研究结果表明，在温室接种过程中，CRISPR/Cas9系统并没有如预期的那样赋予非洲木薯有效的病毒抗性。33％至48％的经过CRISPR/Cas9基因编辑后的病毒基因组进化出一个保守的单核苷酸突变，该突变赋予病毒对CRISPR/Cas9切割的抗性。
也就是说，非洲木薯花叶病毒在CRISPR/Cas9基因编辑的选择压力下，进化出了一种可遗传的突变病毒株，这种突变病毒可以逃过CRISPR/Cas9系统的切割作用。
研究人员在模式植物本生烟（Nicotiana benthamiana）中进一步研究了该突变病毒株，发现这一新型突变病毒的复制依赖于野生型病毒的存在。也就是该突变病毒还不能单独存在和传播。
基于这些研究结果，该研究团队认为，虽然研究中出现的抗性病毒不具有独立感染能力，但是这种突变体可能是真正致病的新型病毒发展的中间过渡态。应当优化使用CRISPR/Cas9来构建抗病毒植物的策略，以减少抗性病毒出现的可能性。
与此同时，应当认真评估有可能加速病毒进化的技术的实施，以防止可能带来的重大的生物安全风险。
对于这一研究发现，Nature 子刊 Nature Biotechnology 杂志发表了题为：CRISPR–Cas9 strikes out in cassava 的评论文章。
该评论文章认为，在2016年，已有研究使用CRISPR/Cas9技术成功构建了抗褐色条纹病毒的非洲木薯，褐色条纹病毒是一种RNA病毒，双生病毒具有和RNA病毒相似的突变率，并且极易发生重组。研究中出现的单碱基突变病毒株可以自发产生，作者没有研究这种缺陷型突变株重组回正常野生型的可能性。
作者在研究中只是用了单一的sgRNA，没能更充分地研究Cas9对植物病毒的编辑潜力。而且也未能证明抗性病毒的出现可能是由于Cas9或sgRNA表达不足所致。
最后，该研究结果也仅限于非洲木薯花叶病毒，不能推广到其他病毒类型。
因此， Nature Biotechnology 杂志评论文章认为，这项研究的作者称CRISPR/Cas9基因编辑触发病毒的进化，有些危言耸听，而且过于笼统。
但同时，该评论文章认为，这项研究结果是新颖的，这是首次在转基因木薯植物研究过Cas9介导的对非洲木薯花叶病毒基因组的切割。而且作者使用深度测序可以在长达8周的时间内对Cas9活性的影响进行详尽的评估，这也是前所未有的。
这项工作大大增加了我们对植物中发生的变化的理解，虽然存在一些不足之处，但如何检测这些转基因植物确实是一个重要问题，根据这项研究结论，它们可能会加速病毒基因组的进化。
因此，应当认真评估有可能加速病毒进化的技术的实施，以防止可能带来的重大的生物安全风险。
参考内容：
https://doi.org/10.1186/s13059-019-1678-3
https://doi.org/10.1038/s41587-019-0169-0
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