Western Blot（WB）可以说是生物学方向的同学最...最基本的实验技能了，然而好看的 WB 总是别人的，自己的 WB 总是杂带丛生，尤其是新课题、新抗体，总在目的条带附近出现非特异性条带。产生这种状况的原因是什么呢、用下面的几个例子，咱们一起研究一下。
案例一：啥也没有
原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
经验：上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
案例二：高背景
原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够
解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
经验：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。
案例三：非特异性条带
原因：一抗非特异性与蛋白结合
解决办法：更换一抗
经验：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。
案例四：条带中出现边缘规则的白圈
原因：电转中膜和胶之间存在气泡。
解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡
经验：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡。
然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。
案例五：条带中间出现白色（反白）
原因：中心部位高浓度HRP把底物消耗过快，中间部位底物消耗结束之后就不发光了
解决办法：降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度。
经验：如果你足够迅速，可以在中间部位底物消耗之前就把X光片给定影出来，但是时间很难把握，建议还是从降低蛋白量，降低一抗二抗浓度入手。
其他问题
（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。
（2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。
（3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。
产生上述现象的时候，不妨先思考几个问题：
你的样品类型是组织还是细胞？
如果是组织，提取物会倾向于有较高的背景和降解条带。
如果是细胞，传代是在 15 代以内还是 15 代以上？
细胞系是否新鲜，有没有加蛋白酶/磷酸酶抑制剂和超声处理？
思考完这些问题，我们一起再从九个方面详细分析一下，哪些因素会导致你的结果出现多条非特异性条带：
-1-
原因：细胞系传代次数过多，蛋白表达谱发生变化。
建议：使用未传代或传代次数较少的细胞系（不超过 15 代）进行样品制备。
-2-
原因：与细胞系裂解物相比，原代细胞或组织提取物会倾向于有较高的背景和降解条带。
建议：用新鲜提取的，经过超声处理的澄清的组织提取物能降低背景；
同时，用去垢剂含量较高的 RIPA buffer 裂解组织，可得到裂解更彻底、一致性更高的裂解物。
-3-
原因：蛋白被降解。
建议：
提取液确保含有蛋白酶抑制剂，并超声；
蛋白样品提取后分装－20 ℃ 或－80 ℃ 短期保存，避免反复冻融，有条件尽量用新鲜提取的蛋白。
-4-
原因：蛋白本身有很多修饰。
建议：查阅文献，确定目的蛋白是否存在多种修饰，泛素化、糖基化等修饰会让蛋白的条带发生较大的偏移。
-5-
原因：所检测蛋白存在多种剪接体，导致分子量大小不同。
建议：查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码 mRNA。
-6-
原因：蛋白存在二聚体或多聚体。
建议：SDS loading buffer 中现用现加 β－巯基乙醇或 DTT。
-7-
原因：样本存在外源转入蛋白。
建议：检查所用样本是否有过被外源进去带有标签的靶标蛋白。如有，更换细胞系样本。
-8-
原因：上样量过多。
建议：根据靶标表达情况，梯度上样跑胶后选择合适的上样量，通常 20~50 g 即可。
-9-
原因：实验操作与 CST 推荐的步骤有较大出入。
建议：
CST 推荐封闭液用 5% 脱脂奶粉／TBST，室温 1 h；
一抗稀释液、稀释比参考抗体说明书，推荐 4 ℃ 过夜孵育；
二抗用 5% 脱脂奶粉／TBST 稀释，工作浓度切忌过高，室温孵育 1 h；
要用 1XTBST 缓冲液充分洗涤。
（内容来源：生物学霸 知凡生物 由小析姐整理编辑）
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