【前沿进展】JVI：哈兽研发现流感病毒聚合酶复制必需的宿主因子及其作用机制

　　近日，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所王晓钧团队首次证明了宿主因子ANP32A/B是甲型流感病毒聚合酶发挥功能所必需的宿主因子，并揭示了其与聚合酶相互作用的关键位点。相关研究以Fundamental contribution and host range determination of ANP32A and ANP32B in influenza A virus polymerase activity为题发表在国际病毒学期刊Journal of Virology上。

　　图. 人源与禽源ANP32A和ANP32B对不同流感病毒的支持模式图

　　甲型流感病毒是具有包膜的单股负链分节段的RNA病毒，根据其表面蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）可分为H1-H18，N1-N11等多种亚型。禽类是A型流感病毒最大的储存库，除H17N10 和H18N11亚型外，禽类能够感染几乎所有已知亚型的A型流感病毒。

　　流感病毒的RNA聚合酶是由PB1、PB2、PA三个聚合酶亚基组成的复合体，是病毒复制的“发动机”，负责病毒RNA的复制和转录。不同宿主来源的病毒聚合酶具有一定的宿主特异性，因此聚合酶的适应性也是病毒种间限制的重要因素。长久以来，科学界一直在探索是否有宿主因子参与流感聚合酶功能并发挥关键作用。近年来应用全基因组筛选技术已发现有多种宿主因子参与到此过程中，但都只起到辅助作用，而非必不可少。

　　酸性核磷蛋白32A（ANP32A）属于ANP32蛋白家族成员，该家族主要包括ANP32A、ANP32B和ANP32E。2016年有科学家报道禽源ANP32A蛋白与禽流感病毒聚合酶的种属特异性相关，但关于ANP32A在流感聚合酶复制过程中的重要性及该家族其他蛋白的功能并未完全揭示。

　　1、huANP32A和huANP32B是不同亚型人流感病毒复制所必须的宿主蛋白

　　研究团队利用CRISPR/Cas9技术构建了一系列聚合酶相关宿主蛋白的HEK293T敲除细胞系，转染H1N1亚型流感A/Sichuan/01/2009（H1N1/SC09）聚合酶报告系统，检测发现人ANP32A（huANP32A）或ANP32B（huANP32B）单独敲除时均不影响聚合酶活性。

　　由于ANP32A与ANP32B为结构类似的同一家族蛋白，因此推测二者可能功能类似，单独敲除一个蛋白，另一个蛋白仍会发挥作用，因此该团队构建了ANP32A&B双敲除的细胞系（DKO）。将不同亚型人流感病毒聚合酶报告系统转染huANP32A单敲除细胞系（AKO）、huANP32B单敲除细胞系（BKO）及DKO，结果显示，在同时缺失huANP32A和huANP32B的情况下（DKO细胞系），不同亚型流感聚合酶活性均下降10000倍以上；同样，WSN病毒感染实验也表明DKO细胞系上病毒的生长复制下降10000倍以上。单独和同时回补ANP32A和ANP32B均可恢复DKO细胞对流感病毒复制的支持，证实huANP32A和huANP32B是不同亚型人流感病毒复制所必须的宿主蛋白，见图1。

　　图1. huANP32A和huANP32B是流感病毒复制过程中必不可少的宿主蛋白

　　2、huANP32A和huANP32B是不同亚型人流感病毒复制所必须的宿主蛋白

　　研究团队评估了不同物种（人、禽、马、猪、犬）流感病毒对不同物种ANP32蛋白的依赖性，发现不同物种流感病毒的聚合酶活性均需要ANP32蛋白的支持，首次揭示了ANP32A和ANP32B是不同物种流感病毒聚合酶发挥功能的决定性宿主蛋白，见图2。

　　图2. 不同物种流感病毒的聚合酶活性均需要ANP32蛋白的支持

　　3、禽ANP32A成为独立支持流感病毒聚合酶活性的ANP32家族蛋白

　　进一步研究发现，禽源ANP32B由于关键位点129/130氨基酸的突变，导致其天然丧失对流感病毒聚合酶活性的支持，见图3。证明禽ANP32A成为独立支持流感病毒聚合酶活性的ANP32家族蛋白，这使得禽ANP32A蛋白作为抗流感病毒设计（转基因抗流感鸡）的唯一靶点成为可能。

　　图3. 禽ANP32A成为独立支持流感病毒聚合酶活性的ANP32家族蛋白

　　4、129/130位点是所有物种ANP32A及ANP32B的与流感病毒聚合酶结合的关键位点

　　研究发现129/130位点是所有物种ANP32A及ANP32B的与流感病毒聚合酶结合的关键位点，也是其发挥支持聚合酶活性的关键功能位点，见图4。突变该位点后所有ANP32蛋白均丧失了与流感病毒聚合酶的结合能力及对流感病毒聚合酶活性的支持。

　　图4. 129/130位点是所有物种ANP32A及ANP32B的与流感病毒聚合酶结合的关键位点

　　本研究成果首次揭示了ANP32A与ANP32B蛋白在不同物种流感病毒复制过程中发挥着决定性作用，同时也为新型抗流感药物及转基因动物的研发提供有效靶点。本研究得到国家自然基金委创新群体项目的资助（31521005）。王晓钧团队成员张海丽、张振宇为文章并列第一作者，王晓钧研究员为通讯作者。

　　ABSTRACT

　　The polymerase of the influenza virus ispart of the key machinery necessary for viral replication. However, the avian influenza virus polymerase is restricted in mammalian cells. The cellular protein ANP32A has been recently found to interact with viral polymerase, and to both influence polymerase activity and interspecies restriction. Here we report that either human ANP32A or ANP32B is indispensable for human influenza A virus RNA replication. The contribution of huANP32B is equal to that of huANP32A, and together they play a fundamental role in the activity of human influenza A virus polymerase, while neither human ANP32A nor ANP32B support the activity of avian viral polymerase. Interestingly, we found that avian ANP32B was naturally inactive, leaving avian ANP32A alone to support vira lreplication. Two amino acid mutations at sites 129-130 in chicken ANP32B lead to the loss of support of viral replication and weak interaction with the viral polymerase complex, and these amino acids are also crucial in the maintenance of viral polymerase activity in other ANP32 proteins. Our findings strongly support ANP32A&B as key factors for both virus replication and adaption.

　　IMPORTANCE

　　The key host factors involvedin the influenza A viral polymerase activity and RNA replication remain largely unknown. Here we provide evidence that ANP32A and ANP32B from different speciesare powerful factors in the maintenance of viral polymerase activity. Human ANP32A and ANP32B contribute equally to support human influenza virus RNA replication. However, unlike avian ANP32A, the avian ANP32B is evolutionarily non-functional in supporting viral replication because of a 129-130 sitemutation. The 129-130 site plays an important role in ANP32A/B and viral polymerase interaction, therefore determine viral replication, suggesting a novel interface as a potential target for the development of anti-influenza strategies.

　　1. Haili Zhang, Zhenyu Zhang, Yujie Wang,Meiyue Wang, Xuefeng Wang, Xiang Zhang, Shuang Ji, Cheng Du, Hualan Chen, Xiaojun Wang. Fundamental contribution and host range determination of ANP32Aand ANP32B in influenza A virus polymerase activity. JVI，2019.

　　DOI: 10.1128/JVI.00174-19

　　2. 哈兽研官网：哈兽研发现流感病毒聚合酶复制必需的宿主因子及其作用机制

　　http://www.hvri.ac.cn/xwzh/zhdt/185834.htm

　　3.中国病毒学英文版.

　　哈尔滨兽医研究所王晓钧研究员组发现新的流感病毒复制相关宿主因子并揭示其功能 | J Virol

　　本期编辑：Annabella