大家好！今天给大家分享一篇最新发表在Virus Research上的综述文章：Development of vaccines against African swine fevervirus，本文通信作者是来自西班牙马德里大学的Daniel Pérez-Núez和YolandaRevilla教授。
自中国2018年8月报道非洲猪瘟以来，目前除西藏、海南和台湾三省外，均有疫情报道。非洲猪瘟不仅给我国养殖业造成了巨大损失，同时在全世界范围内呈扩张趋势。目前上普遍采取扑杀来净化非洲猪瘟，然而仅仅扑杀不足以防控该病进一步扩张，因此国际上对非洲猪瘟疫苗的呼声一直居高不下。本文从非洲猪瘟疫苗、疫苗生产细胞系和DIVA检测三个方面介绍了目前非洲猪瘟疫苗研究概括和挑战。
01
ASFV疫苗研究
科学家们曾尝试过研发ASFV灭活疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗、DNA+蛋白疫苗、活载体疫苗和减毒活疫苗，但由于安全性和保护效力不理想，目前市场上仍然没有ASFV疫苗。
灭活疫苗和亚单位疫苗
灭活疫苗和亚单位疫苗的缺点是不能产生持久的免疫应答。由于ASFV粒子结构复杂，细胞内外病毒粒子都具有感染性和抗体的保护力较差甚至能加剧疾病，使得ASFV灭活疫苗在佐剂作用下也不具有保护效力。
研制亚单位疫苗的关键是鉴定ASFV刺激机体免疫应答的主要抗原。但由于ASFV基因组编码167个ORFs，这就使得基于生物信息学和IFNλ ELISPOTS方法筛选关键抗原变得十分困难。
ASFV的内化过程能被p30抗体阻断，吸附过程则被p12、p72或p54抗体阻断，但用p30或p54免疫猪时尽管能产生中和抗体却不能保护急性ASF感染。杆状病毒表达的p30、p54和p72免疫猪时也不能提供保护。然而，杆状病毒表达的EP402R/CD2v免疫猪后能提供同源ASFV攻毒保护。有研究报道，T细胞免疫在抗ASFV感染过程中也发挥重要作用。
科学家们也曾尝试过DNA亚单位疫苗，他们的策略是将p30和p54基因克隆到识别SLA-Ⅱ的免疫球蛋白可变区，从而实现病毒抗原的直接提呈。尽管检测到T细胞应答，但却检测不到中和抗体，也不能对强毒提供免疫保护。与之类似的是，将编码ASFV血凝素（HA）胞外结构域融合的p30和p54的DNA对猪进行免疫后，能诱导体液免疫和细胞免疫，但不能提供保护。对这些病毒基因进行泛素化修饰后，尽管不诱导中和抗体，但能刺激强烈的CD8+T细胞应答，因此能提供部分保护。
最近一项研究中，Pérez-Núez将病毒蛋白和cDNA联合使用，发现能够体外刺激中和抗体产生，体内实验能刺激IFNγ产生。然而，免疫猪后却不能提供对强毒Armenia07的攻毒保护。
总之，DNA和抗原肽疫苗能够刺激中和抗体产生以及特异性T细胞应答，但只能提供部分保护。
最近，研究人员尝试使用非复制的牛痘病毒包括MVA和NYVAC以及甲病毒和腺病毒等表达ASFV抗原来研制活载体疫苗。表达ASFV结构蛋白的重组MVAs免疫动物后能刺激特异性T细胞应答。表达ASFV抗原肽的腺病毒载体也能够刺激产生特异性抗体和细胞免疫。值得关注的是，重组活载体疫苗能促进减毒ASFV OURT88/3的抗原识别，可能会增强免疫保护效果。尽管重组活载体亚单位疫苗前景广阔，并且有望在安全性上代替活减毒疫苗，但其在保护效力上仍然有待提高。
减毒活疫苗（LAVs）
减毒活疫苗既能刺激先天性免疫，也能激活适应性免疫。研制减毒活疫苗的策略主要是对涉及免疫逃逸、毒力或免疫抑制的ASFV基因进行修饰，以期减少疫苗的副作用并且对其进行DIVA标记。
表1活减毒疫苗类型、疫苗生产细胞系和攻毒保护率
疫苗类型
毒株
ASFV/重组ASFV
生产细胞系
攻毒
存活率
自然弱毒株
NH/P68
NH/P68
PAM
同源L60
100%
异源Armenia07
100%
COS-7
（percoll纯化）
33%
OURT/88/3
OURT/88/3
BM
同源OURT/88/1
100%
异源UG65
100%
基因修饰的自然弱毒株
NH/P68
NH/P68ΔA238L
COS-7
同源L60
100%
0%
NH/P68ΔA224L
COS-7
同源L60
100%
50%
NH/P68ΔEP153R
COS-7
同源L60
100%
0%
COS-7
40%
NH/P68ΔA276R
PAM
0%
OURT/88/3
OURT/88/3ΔDP71LΔDP96R（ΔDP2）
BM
66%
基因
修饰的强毒株
Georgia07
Georgia07Δ9GL
PBM
同源Georgia07
100%
Georgia07ΔMGF
PBM
100%
Georgia07Δ9GLΔMGF
PBM
0%
Georgia07Δ9GLΔDP96R/UK
PBM
100%
Benin 97/1
Benin 97/1ΔDP148R
BM
同源Benin 97/1
100%
Benin 97/1ΔMGF
BM
100%
Ba71
BA71ΔEP402R
COS-1
同源E75
100%
100%
来源于强毒的减毒活疫苗研制LAVs的策略之一是对强毒中涉及病毒毒力和宿主免疫逃逸的基因进行修饰从而对强毒进行致弱。科学家们曾尝试过对ASFV红细胞吸附的基因EP402R、毒力基因9GL（B119L）和UK（DP96R）、多基因家族MGF360/505、涉及抑制IFN应答的基因敲除来使强毒致弱。研究发现，对强毒ASFVGeorgia07的6个MGF360/505基因或对9GL进行敲除后，免疫动物后都能提供对亲本毒株的攻毒保护。对MGF360/505和9GL同时敲除后，虽然安全性提高了，但却失去了保护效力，说明一定的病毒复制水平对保护力至关重要。然而，对ASFV Georgia07的9GL和UK基因同时敲除时则能提供对亲本毒株攻毒的100%保护。以上结果表明，对多个功能基因的敲除是涉及疫苗保护力和安全性的关键。与之类似的是，动物免疫BeninΔDP148R和BeninΔMGF都能提供同源病毒的100%保护。最近研究发现，CD2v（EP402R）是涉及病毒致弱和保护率的关键因子。BA71VΔCD2v免疫后不仅能提供同源病毒的攻毒保护，也能提供异源病毒Georgia07（基因Ⅱ型）和E75（基因Ⅰ型）的攻毒保护。有趣的是，一定的病毒感染水平对保护力的产生也是至关重要的。当敲除Georgia07的TK基因后，病毒被完全致弱，随之也不能诱导保护力产生。但是，敲除Malawi的TK基因致弱后却能提供同源病毒的攻毒保护。虽然强毒致弱后能提供保护力，但面临其和野毒重组从而造成新流行的风险。
来源于自然弱毒的减毒活疫苗研制LAVs的策略之二是对自然弱毒进行修饰。目前研究最多的自然弱毒是OURT88/3和NH/P68。自然弱毒株免疫猪后能提供高水平的保护，但副作用较大，因此一般需要对其进行标记和优化副作用后才能用于疫苗研制。最近，Gallardo等研究发现用ASFV-NH/P68作为LAVs免疫后，能提供对欧洲流行的强毒Armenia07的攻毒保护。用猪肺泡巨噬细胞产生的NH/P68免疫后能提供对同源毒株（Lisbon60）和异源毒株（Armenia07）攻毒后的100%保护率，但副作用较大。为了减少自然弱毒LAVs的副作用，研究人员对ASFV涉及免疫和炎性应答、C型凝集素途径和调控细胞凋亡的基因包括A238L、EP153R、A224L和A276R等进行了敲除。用COS-7细胞生产的NH/P68ΔA238L、NH/P68ΔEP153R和NH/P68ΔA224L免疫后能提供对Lisbon60的攻毒保护，但却丧失了对Armenia07的攻毒保护。有人认为细胞类型比基因敲除对保护力的影响更大，因为NH/P68ΔA238L纯化后则恢复了部分保护力。
致弱的OURT88/3免疫后由于能刺激IFNγ的产生因而也能提供对异源毒株攻毒的部分保护。研究人员希望对OURT88/3的DP71L和DP96R进行敲除以期减少病毒血症和副作用，但均以失败告终，因为这些基因敲出后显著降低了疫苗的保护力。
02
ASFV疫苗生产细胞系
ASFV主要感染猪的单核巨噬细胞和组织巨噬细胞包括肺泡巨噬细胞，因而这两种细胞系在研究病毒与宿主的相互作用上具有得天独厚的优势，然而由于制备成本高，限制了其作为ASFV疫苗工业化生产的细胞系。目前Vero细胞和COS-7细胞是用于ASFV感染模型的主要细胞系，但也存在其不足。BA71V和Georgia07需要在Vero细胞上多次传代适应，这就可能导致其在家猪中复制能力的丧失。ASFV Stavropol 01/08 9k毒株在A4C2/9K细胞上传代33次后丧失了对猪的致病力。
研究表明，骨髓巨噬细胞生产的自然弱毒株OURT/88/3和肺泡巨噬细胞生产的NH/P68能提供异源UG65和Armenia07毒株100%的攻毒保护。然而，用COS-7细胞生产的NH/P68免疫后保护率只有33%。以上结果表明，用于LAVs生产的细胞系不仅对工业化生产至关重要，也能显著影响疫苗的免疫原性。值得注意的是，用COS-1细胞生产的BA71VΔEP402R则不会影响其保护率。有研究表明IPAM3D4/21细胞比其他细胞克隆如3D4/2或3D4/21对ASFV Lillie更易感。Weingartl等建议应根据细胞克隆对培养基进行优化以达到最佳感染的目的。据报道，IPAM（CRL-2845）、IPAM-CD163、WSL或CΔ2+都不是成熟的巨噬细胞，其中只有WSL细胞系能够支持病毒的持续复制。目前只有NH/P68能在这些细胞系中有效复制，而E70和Armenia07在这些细胞中则表现为复制缺陷。令人振奋的是，体内实验表明，用WSL细胞系生产的NH/P68能够感染猪并且在猪体内复制。因此，WSL是最具前景的用于研制ASFV-LAVs的细胞系。
03
DIVA检测
ASFV疫苗研发的另一挑战是要区分疫苗株和野毒感染。目前科学界一致认为ASFV自然弱毒株在没有特异标签的情况下不能用于疫苗株。为了区分疫苗接种和自然感染，可以对LAVs进行阳性和阴性标记。阳性标记比较直接，可以在ASFV基因组中插入GFP、β-Gal、β-Gus或其他标签，以便用分子或血清学方法进行鉴定。而阴性标记则是首先对非疫苗免疫的ASFV感染猪进行抗体检测。因此，疫苗研发时应同时考虑DIVA检测，并且和疫苗接种的实际情况相适应。
未来的研究一方面需要深化对ASFV免疫机制的认识，揭示与保护力相关的病毒抗原。亚单位疫苗的研发依赖于病毒靶点的鉴定和提送途径的优化，从而实现病毒抗原的正确提呈和保护性免疫应答的激活。另一方面，在提高ASFV LAVs保护力的同时应增加其安全性，减少副作用，并且要有效区分疫苗株和野毒的感染。对ASFV致病性和免疫原性的研究对安全且有效ASFV疫苗的研发也至关重要。
作者：王俊
来源：中国动物传染病学报
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