Plant Cell | 深圳大学陈雪梅团队揭示拟南芥PP4复合体促进microRNA转录和加工的机制

蛋白磷酸酶4（PROTEIN PHOSPHATASE4，PP4）是一类在真核生物中高度保守的丝/苏氨酸磷酸酶【1】，其复合体包括一个催化亚基（PP4C）和两个调节亚基 (PP4R2和PP4R3)【2】，能参与DNA损伤修复。编码三类亚基的基因在植物中都有相应的同源基因，但是在植物中PP4复合体的组成和功能尚不清楚。对PP4的分子功能和生物学功能的研究仅限于具有明显发育表型的psy2l/smek1突变体中【3,4】，而对编码催化亚基的PPX1和PPX2 研究得较少。

植物 microRNA（miRNA）是一类20-24 nt的小RNA, 能与Argonaute (AGO) 蛋白结合，通过切割降解mRNA或抑制mRNA的翻译从而介导靶基因的转录后沉默。miRNA的生物合成包括一系列步骤【5】：DNA依赖的RNA聚合酶II (Pol II) 对编码miRNA的基因 (MIR genes) 进行转录，产生priRNA；DICER-LIKE 1 (DCL1) 把priRNA加工成具有颈环结构的前体（pre-miRNAs)，之后在细胞核中形成miRNA/miRNA*duplex【6】。DCL1与 HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1) 和SERRATE (SE) 相互作用而形成剪切复合体（Dicing complex），在细胞核中被称为剪切小体（Dicing bodies, D-bodies) 【7】。

近日，深圳大学陈雪梅团队在 The Plant Cell 上发表了题为The PROTEIN PHOSPHATASE4 Complex Promotes Transcription and Processing of Primary microRNAs in Arabidopsis 的研究论文，揭示了拟南芥中PP4在调控细胞核RNA方面的功能和其组成的复杂性，并且鉴定了一种包含调节亚基PP4R3A的复合体组成类型。陈雪梅院士和莫蓓莘教授为该论文的通讯作者。

该研究通过遗传筛选鉴定到一种影响miRNA积累的突变体，进一步的研究表明这种突变体的表型是由于PSY2L/SMEK1的编码基因发生了突变而导致。研究人员发现，PSY2L/SMEK1在拟南芥基因组上有一个未注释且能够表达的同源基因，并把 PSY2L/SMEK1和它的同源基因分别命名为PP4R3A和PP4R3B。 pp4r3b 突变体没有明显发育表型，与pp4r3a 杂交得到的双突变体pp4r3a pp4r3b 与pp4r3a 在植物形态和miRNA积累方面的表型相似，且转入PP4R3B基因不能互补pp4r3a的表型。

pp4r3a与pp4r3b的表型

通过对PP4R3A进行免疫沉淀和质谱分析，该研究进一步鉴定到PPX1, PPX2和PP4R2L。ppx1和 ppx2的单突变体与野生型相比没有明显的表型，但是ppx1 ppx2 双突变体与pp4r3a 突变体的表型类似。相关的遗传和生化数据表明，PP4R3A和PPX1, PPX2都参与miRNA的生物合成。

ppx1 和 ppx2 的表型

pp4r3a 突变体中pri-miRNA的转录水平下降，表明PP4R3A促进了MIR 基因的转录。研究人员通过核质分离、提取染色质并进行免疫印迹实验，发现PP4R3A位于细胞核中并能结合染色质；对PP4R3A进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验，表明PP4R3A在MIR 基因的启动子区域富集。接下来，研究人员通过CO-IP实验证明Pol-II最大亚基RBP1与PP4R3A有互作；通过ChIP实验发现Pol II和PP4R3A在MIR 基因的启动子区域共同富集。进一步的ChIP实验表明，RBP1在野生型和pp4r3a-1突变体背景下在被检测的MIRs上都有富集，但在pp4r3a-1 突变体背景下的富集有明显下降。这些结果表明，PP4R3A通过招募Pol II到MIR基因的启动子区域而促进MIR基因的转录。

研究人员推测，pri-miRNA的转录受阻可能会影响伴随转录的加工。他们发现，在pp4r3a-1突变体中，含有HYL-YFP的D-body的数量相对野生型中显著降低。进一步的ChIP实验发现，HYL1在所检测的MIR位点有富集，但是其在pp4r3a-1突变体中的富集下降。而PP4R3A在野生型和hyl1-2突变体背景中在这些位点的富集差异不大。这些结果表明，PP4R3A对于D-body的形成和招募HYL1到MIR基因是必需的。

PP4R3A和Pol-II的互作提示，PP4R3A可能影响除了MIR基因之外其它一些基因的转录。因此，研究人员对野生型和两种pp4r3a突变体进行了RNA-seq分析，相对野生型而言，尽管突变体中miRNA整体水平降低，且一些miRNA的靶基因确实转录上调，但是大部分转录上调的基因都不是已知miRNA的靶点，这说明PP4R3A可能也影响这些基因的转录。通过分析，研究人员还发现突变体中内含子保留（intron retention）现象比野生型增加，几百个内含子出现了剪接异常。这表明，PP4R3A对细胞核RNA具有广泛的调节功能。

pp4r3a 突变体中基因表达和Pre-mRNA的剪接受到影响

总之，本研究通过研究拟南芥PP4复合体的组成和功能，揭示了PP4复合体能够协调miRNA转录和加工，并且在细胞核RNA的调节方面具有广泛的作用。

参考文献

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http://www.plantcell.org/content/early/2019/01/23/tpc.18.00556