显微共聚焦拉曼光谱仪应用｜SERS实现对腺苷的超灵敏检测

01 研究背景

腺苷是腺嘌呤核苷酸的代谢产物，作为体内重要的神经调节分子之一，在能量代谢、基因调控及神经兴奋性之间发挥着关键的连接作用。腺苷已被公认为一种内源性抗惊厥和神经保护分子，其激动A1受体亚型的作用，在中风、脑损伤、疼痛及癫痫等疾病的治疗中具有重要价值。此外，腺苷还被视为潜在的肿瘤标志物，癌症患者体内的腺苷水平通常显著高于健康人群。因此，开发一种高灵敏度、高特异性的腺苷检测方法，对医学及生物技术领域具有重要意义。

表面增强拉曼光谱（SERS）技术能够将吸附在粗糙金属表面分子的拉曼信号大幅放大，是生物医学检测领域的重要分析手段。然而，如何制备兼具高灵敏度、高稳定性和高重现性的SERS基底，一直是该技术走向实际应用的关键挑战——石墨烯凭借其原子级厚度和无缝的二维晶格结构，被认为是理想的"外壳隔离"材料，既能保护金属纳米颗粒不被氧化，又能凭借其超大比表面积富集待测分子。

本研究开发了一种通过化学气相沉积（CVD）方法，将石墨烯直接生长包裹在铜纳米颗粒表面的SERS基底（G/CuNPs），并将其应用于水、血清及尿液中腺苷的超灵敏检测。

02 实验方法

研究采用双温区CVD热壁反应器，通过甲烷和氢气混合气氛，在铜纳米颗粒表面直接生长单层石墨烯外壳，制备出石墨烯包裹铜纳米颗粒（G/CuNPs）复合SERS基底。作为对照，研究同时制备了未包裹石墨烯的纯铜纳米颗粒（CuNPs），以及通过转移法将预先生长的石墨烯薄膜覆盖在铜纳米颗粒表面的对照基底（TG/CuNPs）。

图1. (a) 生长装置示意图。一条铜箔沿管壁环绕放置，作为悬浮催化剂提供铜纳米颗粒。基底放置在距铜箔条10 cm处。(b) 石墨烯生长机理示意图，展示了浮游铜与氢气分解甲烷的过程。铜原子在1050°C从铜箔升华，并在达到一定浓度后演变为铜纳米颗粒。石墨烯开始在氢气和甲烷的混合气氛中于铜纳米颗粒表面生长。

拉曼光谱检测参数： 采用532 nm激光激发，通过20×物镜聚焦，激光光斑约0.5 μm，入射激光功率保持在0.5 mW。检测前使用硅标准品在520 cm⁻¹处的特征峰进行仪器校准。SERS基底在待测溶液中浸泡2.5小时，随后从至少8个相隔3 mm以上的随机位置进行拉曼信号采集，单次积累时间30秒。

图2. G/CuNPs、CuNPs和TG/CuNPs在石英基底上的SEM图像。(a) 低倍放大下G/CuNPs的SEM图像。(b) 较高倍放大下G/CuNPs的SEM图像。(c) G/CuNPs的拉曼光谱。(d) 生长在石英基底上的CuNPs的SEM图像。(e) 石英基底上TG/CuNPs的SEM图像。(f) CuNPs的拉曼光谱。

样品制备： 分别配制不同浓度的腺苷水溶液、稀释人血清（含不同浓度腺苷）样品，以及健康志愿者晨尿样本进行检测。

03 结果与讨论

3.1 石墨烯包裹结构显著提升了SERS增强效果

对比G/CuNPs、TG/CuNPs及纯CuNPs三种基底对10⁻⁶ M腺苷溶液的检测效果，腺苷的多个特征拉曼峰（725、1483、1508、1576 cm⁻¹等环呼吸振动模式；847 cm⁻¹的C-O-C骨架振动；1307 cm⁻¹的N-C-N及C-C-N伸缩振动等）在G/CuNPs基底上的强度，比TG/CuNPs基底强2-5倍，比纯CuNPs基底强8.8-20倍。这一结果表明，通过直接生长方式使石墨烯与铜纳米颗粒紧密贴合，相比转移法覆盖或裸露金属表面，能够获得更强的SERS增强效果。

图3 三种SERS基底（G/CuNPs、TG/CuNPs、CuNPs）检测10⁻⁶ M腺苷溶液的拉曼光谱对比，各特征峰位置及强度差异清晰可见

3.2 检测极限达到纳摩尔级别

以847和1337 cm⁻¹两处特征峰为定量依据，对不同浓度腺苷水溶液进行检测，G/CuNPs基底的最低检出浓度可达10⁻⁹ M（1 nM），比TG/CuNPs基底低一个数量级，比纯CuNPs基底低两个数量级。在10⁻⁹至10⁻⁴ M浓度范围内，两处特征峰强度与腺苷浓度均呈现良好线性关系，线性相关系数分别达到0.995和0.998。

图4 (a) 腺苷在 G/CuNPs 上的拉曼光谱，浓度范围为 10⁻⁹至 10⁻⁴ mol/L。(b) 腺苷在 TG/CuNPs 上的拉曼光谱，浓度范围为 10⁻⁸至 10⁻⁴ mol/L。(c) 腺苷在 CuNPs 上的拉曼光谱，浓度范围为 10⁻⁷至 10⁻⁴ mol/L。(d) G/CuNPs 基底上腺苷在 847 cm⁻¹ 和 1337 cm⁻¹ 处特征峰的拉曼强度随腺苷分子浓度的变化关系，两处峰对应的决定系数 (R²) 分别高达 0.995 和 0.998。

3.3 血清和尿液中腺苷特征峰依然清晰可辨

在稀释人血清中添加5-500 nM不同浓度的腺苷进行检测，血清背景中腺苷的特征拉曼峰强度依然与纯乙醇水溶液中相近，血清本身仅贡献少量微弱的额外峰，不影响腺苷信号的识别，最低检出浓度同样达到5 nM，线性相关系数为0.993。在健康志愿者尿液样本中，无需额外分离纯化，苯丙氨酸（1002、1593 cm⁻¹）、脂类（1436、1460 cm⁻¹）等尿液本底成分的特征峰与腺苷相关峰（725、847、1307、1337、1371、1390、1483、1508 cm⁻¹）能够同时被清晰识别；经核苷提取纯化后，腺苷相关特征峰的强度进一步增强，更加突出。

图 5. (a) 稀释血清中的腺苷在 G/CuNPs 基底上测得的拉曼光谱，腺苷浓度范围为 5 至 500 nM。(b) 稀释血清中腺苷在 G/CuNPs 上 1337 cm⁻¹ 处的拉曼强度，为腺苷浓度的函数。

图 6. (a) 在 G/CuNPs 基底上测得的正常人尿样拉曼光谱（上方曲线），以及作为参照的 100 nM 浓度腺苷拉曼光谱（下方曲线）。(b) 在 G/CuNPs 基底上测得的正常人尿样中排泄核苷的拉曼光谱（上方曲线），以及作为参照的 100 nM 浓度腺苷拉曼光谱（下方曲线）。

3.4 石墨烯外壳同时提升了基底的化学稳定性

将G/CuNPs、TG/CuNPs及纯CuNPs置于85℃、80%湿度环境中进行240小时热氧化处理，G/CuNPs基底检测腺苷的SERS信号强度几乎没有变化；TG/CuNPs基底信号出现明显下降；而纯CuNPs基底信号大幅减弱，部分特征峰甚至完全消失。这一结果表明，直接生长的石墨烯外壳能够有效隔绝氧气和水分对金属纳米颗粒的氧化侵蚀，显著提升SERS基底的长期化学稳定性。

图7 G/CuNPs、TG/CuNPs、CuNPs三种基底经240小时热氧化处理后的SERS信号强度对比，G/CuNPs信号基本保持不变

04 结论

本研究表明，通过化学气相沉积法直接在铜纳米颗粒表面生长石墨烯外壳制备的SERS基底（G/CuNPs），能够实现对腺苷的超灵敏、无标记检测，在水中检测极限达到1 nM，在血清中达到5 nM，线性检测范围跨越5个数量级。该基底在水、血清、尿液三种不同基质中均能清晰识别腺苷的特征拉曼峰，且经过240小时高温高湿老化测试后信号强度基本保持不变，展现出优异的化学稳定性和重现性。这一结果为腺苷在肿瘤标志物筛查、神经系统疾病诊断及治疗监测等医学场景中的实际应用提供了可靠的检测手段。

05 文章来源

Direct Growth Graphene on Cu Nanoparticles by Chemical Vapor Deposition as Surface-Enhanced Raman Scattering Substrate for Label-Free Detection of Adenosine

Shicai Xu, Baoyuan Man, Shouzhen Jiang, Jihua Wang, Jie Wei, Shida Xu, Hanping Liu, Shoubao Gao, Huilan Liu, Zhenhua Li, Hongsheng Li, Hengwei Qiu

Shandong Provincial Key Laboratory of Functional Macromolecular Biophysics, Institute of Biophysics, Dezhou University；College of Physics and Electronics, Shandong Normal University, China

06 产品推荐

上述研究中SERS基底表征及腺苷检测所需的核心能力——532 nm精准激发、显微物镜精确聚焦微弱信号、宽波段特征峰识别——如海光电Mars便携式显微共聚焦拉曼光谱仪均可实现：

· 532 nm单模激光器，与本研究实验条件完全一致；配置10×、20×、50×多种物镜可选，与本研究所用20×物镜聚焦方式相匹配，可实现微米级空间分辨率的精确定位检测

· 拉曼光谱范围可覆盖200-3000 cm⁻¹，完整覆盖本研究中石墨烯特征峰（D峰~1360 cm⁻¹、G峰~1580 cm⁻¹、2D峰~2695 cm⁻¹）及腺苷特征峰（725-1650 cm⁻¹）所在的全部区间，可同时完成SERS基底本身的石墨烯质量表征与目标分子的检测分析

· 激光功率0-100 mW连续可调，调节精度≤1 mW，可根据SERS基底增强效果灵活调整激发强度，避免信号饱和或过弱

· 单晶硅三阶峰信噪比≥10:1，满足纳摩尔级别微弱SERS信号的高信噪比检测需求

· 软件具备谱峰识别、谱峰面积计算及2D渲染拉曼热力学高光谱成像功能，可用于评估SERS基底表面增强效果的均匀性分布

无论是新型SERS基底材料的开发验证，还是生物标志物、环境污染物等痕量物质的超灵敏检测，Mars显微共聚焦拉曼光谱仪均可提供稳定可靠的分析解决方案。