上海
2012年，Jennifer A. Doudna和Emmanuelle Charpentier在Science上发表论文，证实tracrRNA和crRNA共同引导Cas9切割靶DNA；并通过人为工程改造，将原本分离的双引导RNA融合为单引导RNA（sgRNA），使Cas9成为可编程基因编辑工具，基因编辑领域由此进入可编程时代。2025年，厦门大学刘亮团队又将sgRNA“拆回”天然的双引导RNA（dual-guide RNA），发现crRNA-tracrRNA引导下的Cas9可被其靶向的dsDNA、ssDNA或ssRNA激活，并对邻近的ssDNA或ssRNA进行反式切割，据此开发出对多种病毒及肿瘤耐药性突变实现高灵敏、高特异检测的核酸检测平台（Nature Biotechnology, 2025）。人类对向导RNA的“融合”与“拆分”，不断拓展着CRISPR-Cas的活性形式与应用边界。这也引出一个耐人寻味的问题：自然界中是否也有生物沿着类似逻辑进化，利用“模拟嵌合向导RNA”来调控CRISPR-Cas？
2026年10月21日，厦门大学生命科学学院刘亮团队与北京大学基础医学院云彩红团队合作，在Cell Host & Microbe在线发表研究论文：A phage-encoded small RNA that mimics chimeric guide to inhibit CRISPR-Cas9。研究首次揭示，噬菌体来源的非编码RNA——rAcrIIA1通过模拟crRNA-tracrRNA的双RNA结构，实现对II型CRISPR-Cas9系统的抑制。在此基础上，研究团队进一步利用rAcrIIA1的可编程性，将其改造为可编程的引导RNA，成功应用于基因编辑。
研究人员通过生物信息学分析，在噬菌体Streptococcus phage Javan584基因组内锁定了一段545 bp的潜在非编码RNA模板序列。该序列的5’端和3’端分别与crRNA重复区及tracrRNA模板序列高度相似，且其两端分别为两个编码anti-CRISPR蛋白（Acr）的开放阅读框。小RNA测序表明，这一区域可特异性转录出一条约111 nt的RNA。随后，研究人员将携带该小RNA的质粒与携带功能性II型CRISPR-Cas9系统的质粒共转化至大肠杆菌。靶向抗性实验与噬菌体抗性实验均表明，该非编码RNA可有效抑制CRISPR-Cas9系统的功能。鉴于它是迄今发现的第一个能够抑制II型CRISPR-Cas9系统的RNA型Acr，研究人员将其命名为rAcrIIA1。
那么，rAcrIIA1究竟如何“锁住”Cas9？研究人员从分子层面追踪了二者的结合方式：高分辨率结构分析显示，rAcrIIA1与Cas9形成的复合物，在整体构型上与Cas9-sgRNA复合物高度相似；进一步的结合竞争实验表明，rAcrIIA1会抢先占据Cas9上的向导RNA结合位点，使功能性crRNA-tracrRNA无法装载到Cas9上，从而阻断Cas9对特异性DNA靶标的识别与切割。换句话说，rAcrIIA1并不是破坏Cas9的催化中心，而是“冒充”向导RNA抢先占位，让Cas9收不到真正的靶向指令。由此，rAcrIIA1被证明是一种竞争性RNA型抑制剂：它通过模拟crRNA-tracrRNA的嵌合结构直接结合Cas9，阻止CRISPR-Cas9干扰复合物的组装。
既然rAcrIIA1能以类似sgRNA的嵌合guide结构与Cas9结合，一个自然的问题是：它能否被“反向工程”为可编程引导RNA，介导Cas9进行靶向基因编辑？为此，研究人员设计了多种携带不同间隔序列的rAcrIIA1变体，并分别在大肠杆菌和293T细胞中开展基因编辑实验。结果表明，重新编程后的rAcrIIA1均能高效引导SpyCas9特异性切割靶标DNA，且编辑活性与目前常用的Cas9-sgRNA系统类似。这些结果说明，rAcrIIA1可作为一种可编程引导RNA，介导Cas9实现序列特异性DNA切割。
在此基础上，研究人员进一步考察了rAcrIIA1激活SpyCas9反式切割活性的能力。在相同实验条件下，以ssDNA作为报告底物时，rAcrIIA1引导的反式切割信号优于经典sgRNA系统。这一结果提示，基于rAcrIIA1的Cas9激活机制有望发展为核酸检测工具。
综上所述，该研究首次将RNA型anti-CRISPR的作用范围拓展到依赖crRNA-tracrRNA双RNA导向的II型CRISPR-Cas9系统，填补了RNA型Acr能否抑制II型Cas9的关键空白。研究不仅揭示了rAcrIIA1通过模拟crRNA-tracrRNA嵌合guide结构、竞争性结合Cas9并阻断功能性干扰复合物组装的分子机制，也展现了自然界噬菌体与人类工程化sgRNA之间耐人寻味的“趋同”：人类用sgRNA给Cas9“编程”，噬菌体则用rAcrIIA1给Cas9“上锁”。更重要的是，研究进一步将这一天然抑制剂反向工程为可编程引导RNA，实现了与sgRNA相当的基因编辑活性，并在反式切割检测中表现出优于经典sgRNA系统的信号，为基因编辑、核酸检测和CRISPR-Cas9精准调控提供了新的分子元件与设计思路。从天然抑制剂到可编程工具，rAcrIIA1不仅拓展了anti-CRISPR的认知边界，也为理解向导RNA的分子进化及开发新型CRISPR技术提供了重要启示。
rAcrIIA1的作用机制及基因编辑工具开发
厦门大学生命科学学院博士后陈莹、北京大学药学院赵鹏副研究员为论文的共同第一作者。厦门大学生命科学学院刘亮教授、陈霁云副教授、北京大学基础医学院云彩红教授为论文的共同通讯作者。
https://www.cell.com/cell-host-microbe/abstract/S1931-3128(26)00406-3
制版人： 十一
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