Cell Stem Cell | Wnt/GSK3B轴失调驱动APOE4少突胶质细胞的脂滴积聚与髓鞘化受损

撰文 | 易

阿尔茨海默病是最常见的神经退行性疾病，现有治疗手段有限，亟需新的干预靶点。大规模遗传关联研究已鉴定出数百个与晚发型阿尔茨海默病相关的基因，其中关联最强的一直落在APOE位点。APOE编码的载脂蛋白E是脑内高表达的脂质转运蛋白，人群中APOE4增加患病风险，携带一个拷贝可使风险升高约3至4倍，纯合携带者可升高至12倍。APOE4已被联系到β淀粉样蛋白聚集、炎症、tau病理与血脑屏障破坏等过程，但其施加风险的具体细胞机制仍不清楚。有研究此前对携带APOE4者死后脑组织做单核RNA测序，发现APOE4与脂质和胆固醇调控紊乱相关，其中少突胶质细胞的异常最为突出。少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，其功能障碍与髓鞘破坏被视为阿尔茨海默病的特征，也被认为可能推动病理进展，因此厘清APOE4如何扰乱其脂质代谢，是寻找新治疗机会的关键。

近日，美国麻省理工学院的Li-Huei Tsai在Cell Stem Cell期刊发表题为Genome-wide CRISPR screen reveals Wnt signaling as a potential therapeutic target for lipid accumulation and impaired myelination in APOE4 oligodendrocytes的研究论文，以全基因组CRISPR敲除筛选与转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）为起点，在诱导多能干细胞（iPSC）来源的少突胶质细胞中锁定Wnt信号下调与GSK3B过度活跃是脂滴积聚的关键调控环节，并证明抑制GSK3B既能减少APOE4少突胶质细胞的脂滴，也能在三维脑类器官与APOE4;PS19 tau转基因小鼠中改善髓鞘化。

研究团队选用纯合携带APOE4的诱导多能干细胞系分化出少突胶质细胞，确认其表达OLIG2与O4等成熟标志物并重现脂滴积聚表型后，把9000万个细胞与同时携带Cas9、靶向全部蛋白编码基因的向导RNA文库共孵育，经嘌呤霉素筛选后再培养10天。随后用BODIPY标记活细胞脂滴，通过荧光激活细胞分选分出信号最高的15%与最低的15%两群细胞，测序向导RNA并以Apron计算富集程度。低脂质负荷群显著富集的包括磷脂酶PLA2G4C与Wnt负调控因子DKK1、NKD1，另有336个基因；高脂质负荷群富集TP53、脂质感受器STARD10、Wnt成员APC2与FZD10，以及另外401个基因，APOE本身也在其中。多个命中基因汇聚于磷脂代谢，低脂质负荷群富集把磷脂酰胆碱裂解为溶血磷脂酸的PLA2G4C与把溶血磷脂酸转为磷脂酸的AGPAT2，高脂质负荷群富集把二酰甘油转为磷脂酸的DGKQ1与把磷脂酸转为CDP-二酰甘油的CDS1。敲除Wnt负调控因子DKK1与NKD1导致低脂质水平，敲除FZD10与WNT16等经典成员则导致高脂质水平。对仅按脂质含量分选的细胞做批量RNA测序得到一致方向：高脂质负荷细胞上调CETP、CERS2与CDIPT，低脂质负荷细胞上调二酰甘油脂肪酶DAGLA与WNT7B、TCF7L1。敲低DKK1或过表达β-连环蛋白均显著减少脂滴。

为理解APOE4如何扰动表观基因组，研究团队用ATAC-seq测序比较除APOE基因型外同源的APOE3与APOE4少突胶质细胞，共鉴定出47999个差异可及区域，映射到9671个蛋白编码基因。APOE4中可及性下降的基因涉及Wnt信号（WNT3、TCF4与CTNNB1）、髓鞘化（MOG、CNP与MBP）与磷脂酰肌醇3激酶-AKT信号，可及性升高的基因涉及磷脂酰胆碱合成、磷脂酶代谢与硫酸类肝素合成；TCF7、LEF1与c-MYC等经典Wnt转录因子基序在可及性降低区域显著富集，与筛选命中基因取交集得到319个共同基因。分析93位老年人死后前额叶皮层的单细胞染色质可及性数据发现，携带APOE4者的可及性降低区域中Wnt相关基序显著富集，且在少突胶质细胞谱系与神经元中尤为明显。免疫组化与免疫印迹进一步显示，APOE4少突胶质细胞中β-连环蛋白降低而GSK3B升高。

既然β-连环蛋白减少而GSK3B升高，研究团队转向这一互抑轴。用Dif3激活APOE3少突胶质细胞的GSK3B，β-连环蛋白下降并出现明显脂滴积聚；反过来用CHIR99021抑制GSK3B可显著减少APOE4细胞的脂滴，并显示单个脂滴内磷脂与胆固醇含量同步下降，加入重组Wnt3a蛋白也足以减少脂滴。转录组与脂质组提示了下游机制：激活GSK3B广泛上调鞘糖脂合成、甘油磷脂代谢与胆固醇代谢基因，脂质组中显著变化的20种脂质里10种为磷脂、6种为鞘脂且多种鞘脂下降；抑制GSK3B则下调HMGCS1、SQLE、SREBF1与SREBF2等胆固醇合成基因，富集核糖体与氧化磷酸化通路，并上调NPC1、LIPA与LAMP1、ATG14等自噬相关基因。在1104种可检测脂质中，CHIR99021处理使27种显著改变，二酰甘油、三酰甘油与神经酰胺一致下降。活细胞脉冲追踪实验显示，抑制GSK3后脂滴与线粒体的关联显著增加，而LC3表达与脂滴-溶酶体共定位无显著变化，提示效应更可能来自线粒体对储存脂质的利用而非脂噬。用带BODIPY标记的甘油磷酸胆碱底物检测还发现，CHIR99021处理后磷脂酶活性显著下降。

少突胶质细胞的核心职能是生成并维持髓鞘，研究团队因此用含髓鞘化少突胶质细胞的三维iPSC来源脑类器官检验恢复Wnt信号的效果。培养20周后，APOE4类器官的髓鞘碱性蛋白免疫反应性显著低于同源APOE3类器官，复现了APOE4相关缺陷；从第18周起用CHIR99021（2 μM）处理两周后，髓鞘碱性蛋白与神经丝蛋白免疫反应性均显著升高，而OLIG2阳性细胞数量不变，提示效应来自现有少突胶质细胞的髓鞘产出增加。

为检验体内效果，研究团队使用与人类化APOE3或APOE4小鼠杂交的PS19 tau转基因小鼠。APOE4;PS19小鼠在6至7月龄时磷酸化tau病理加重，海马髓鞘碱性蛋白免疫反应性早在3月龄即降低，而OLIG2阳性细胞数量不变。脂滴染色显示，3月龄与6月龄时海马脂滴主要位于NeuN阳性神经元内，占90%至100%，两种基因型之间没有差异；约9至10月龄时APOE4;PS19小鼠脂质积聚明显增加，但该结果受样本量有限的影响，到9月龄时可在OLIG2阳性少突胶质细胞内检出PLIN2阳性脂滴，65%的少突胶质细胞至少含有一个脂滴。对5月龄小鼠按5 mg/kg腹腔注射CHIR99021两周，海马脂滴显著减少；对8月龄小鼠给药6周后海马髓鞘化显著增加，而OLIG2阳性细胞数、GFAP免疫反应性以及小胶质细胞的数量与形态均无变化。研究团队还检测了苏氨酸181与丝氨酸396位点的tau磷酸化，未发现显著改变。

综上所述，本研究把全基因组遗传筛选与表观基因组、脂质组、转录组及多层次模型结合，揭示APOE4少突胶质细胞中Wnt/β-连环蛋白信号下调、GSK3B过度活跃驱动脂滴积聚并损害髓鞘化，并把GSK3B确立为可药理学干预的潜在靶点，在人类细胞模型与转基因小鼠中同时获得验证，为APOE4相关阿尔茨海默病勾勒出从遗传风险到脂质代谢再到髓鞘病理的机制链条。

https://doi.org/10.1016/j.stem.2026.09.012

制版人： 十一

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