Cell | 基于T2T组装绘制癌症体细胞突变全景图谱，揭示16%的突变位于参考基因组盲区

体细胞突变发生在所有人体组织中，并在健康细胞中终生积累，影响着人类的发育、疾病、衰老和其他生理指标。虽然近年来的测序技术揭示了多种突变特征，但体细胞突变的全貌仍未完全阐明。2023年5月，美国国立卫生研究院启动了“跨人体组织的体细胞嵌合（SMaHT）”项目，该计划旨在绘制人体组织中体细胞突变的全面参考图谱，并分析这些遗传变异对健康和疾病的影响。

近日，华盛顿大学团队联合SMaHT Assembly工作组在Cell发表文章“A telomere-to-telomere map of somatic mutation burden and functional impact in a cancer”。研究团队通过将供体近端粒到端粒（near-T2T）二倍体组装与深度短读长和长读长测序结合，对黑色素瘤样本进行分析，报道了首个完整的癌症体细胞突变图谱。该图谱揭示了此前体细胞突变分析难以触及的维度，阐明了其高重复区域内的不稳定性机制，并为癌症发生过程的T2T研究提供了蓝图。

图1.研究概述

癌症基因组中存在广泛的体细胞突变，但基因组中的大部分区域仍无法通过传统的参考序列方法进行检测。SMaHT Assembly工作组主要利用最新的T2T组装‌和长读长测序等技术改进体细胞变异检测，解决常规线性参考基因组（如GRCh38）因遗漏个体特异性体细胞变异导致变异判定误差的问题。

研究团队首先对COLO829黑色素瘤癌细胞进行了短读长（Illumina、Element AVITI）和长读长测序（PacBio HiFi和超长Oxford Nanopore），发现长读长测序数据比对到GRCh38或T2T-CHM13人类基因组组装时，出现了显著的比对伪影，这些伪影似乎集中在着丝粒、亚端粒、片段重复以及其他卫星区域，表明仅靠长读长测序无法将体细胞变异图谱扩展至这些复杂的位点。

为克服这些映射伪影，研究团队又对同源淋巴母细胞系（COLO829BL）进行了长读长和Hi-C测序，并组装了一套体细胞突变图谱COLO829BL DSA（图2），作为参考对COLO829黑色素瘤癌细胞进行体细胞突变检测。该图谱基因组序列为5.92Gb，包含12条染色体的T2T组装，且包含了人类所有46条染色体着丝粒的完整序列。

为了以无偏的方式评估几乎整个COLO829BL基因组中的体细胞突变，包括在GRCh38中缺失的区域，研究团队进一步构建了一个基于供体特异性的图谱基因组，包含每个COLO829BL DSA单倍型以及GRCh38和T2T-CHM13的单倍体组装。该COLO829BL供体特异性图谱显示，COLO829BL DSA中有342.87 Mb（5.87%）的序列在GRCh38中缺失。

图2.黑色素瘤细胞系中体细胞突变的T2T图谱分析。

基于图谱的分析发现，COLO829细胞中有15条单倍体染色体存在整条染色体重复、6条存在整条染色体缺失，另有6条存在染色体臂缺失或重复，且这些断裂点在核型上均定位至着丝粒（图2C）。对COLO829的6条染色体非整倍体断裂点的精细分析显示，有4个断裂位点定位在α卫星高阶重复序列（HORs）上（图2E、F），其特异性断裂位点在GRCh38和CHM13参考基因组中均完全缺失，其中3个断裂位点中的2个仅存在单碱基微同源性。

随后，研究构建了COLO829特异性的体细胞单核苷酸多态性（sSNV）全基因组图谱进一步扩展分析。通过将COLO829BL DSA图谱与供体特异性图谱结合，采用深度长读长测序、短读长测序识别并验证了在COLO829传代中存在而在COLO829BL中缺失的sSNV，包括44,795个sSNV和828个体细胞双核苷酸变异（sDNV）（图3）。分析发现，15.6%sSNV被映射到GRCh38中缺失的区域（图3A），包括599个sSNV被映射到非重复性位点，且这些位点仅存在于COLO829BL DSA图谱中。

图3.COLO829细胞系中体细胞SNV的全基因组分析。

该供体基因组4.27%的卫星重复序列极易积累突变，尤其是与紫外线相关的突变特征。通过比较不同重复序列间的sSNV丰度，发现重复序列在COLO829位点中携带的sSNV数量显著高于非重复序列（高出1.4倍），而卫星重复序列则表现出最高的sSNV丰度（比非重复元件高出3.79倍）（图4）；不同类别的卫星重复序列之间sSNV丰度存在5.05倍的差异，其中HSat2序列的sSNV丰度最高，达到6.1 × 10⁻⁵个sSNV/bp（比非重复序列高7.78倍）。

除重复序列外，研究还发现动粒结合区域也是COLO829中sSNV的热点区域。COLO829BL的CDR区域相对于其他α-卫星HOR区域，其sSNV负荷显著更高。

图4. 卫星重复序列是紫外线相关sSNV富集区域。

上述分析表明，着丝粒-动粒结合域是染色体臂非整倍体断裂位点及体细胞遗传变异的热点区域，那么这些特征在非癌组织中又是如何呢？

研究团队利用COLO829BL细胞的长读长测序数据识别了COLO829BL细胞培养物中的着丝粒sSV。结果显示，在肿瘤发生之外，着丝粒sSV的形成可能由动粒相关断裂及同源定向修复机制驱动。因此，着丝粒sSVs的形成方式与断裂诱导复制过程一致，既存在于正常人类发育过程中，也存在于癌症发生过程中。

在表观遗传方面，研究发现COLO829BL与COLO829细胞之间着丝粒-动粒结合区域在大小、位置和组织结构方面存在显著的表观遗传差异，表明肿瘤的发生可能与COLO829细胞中动粒结合区域的表观遗传重组有关。COLO829的着丝粒-动粒结合域相对于COLO829BL区域大51%，其位置也发生了约65kb的移动；两组细胞之间的CpG甲基化结构的发生大规模重组，每个COLO829BL着丝粒上标记了约4个独立的结合区域，COLO829着丝粒仅标记了约1个。

图5.着丝粒内的体细胞表观遗传变异。

此外，ONT长读长测序数据显示，COLO829的端粒比COLO829BL短约2.4kb。为此，研究进一步探究了COLO829端粒内的突变过程，发现COLO829细胞在获得启动子TERT突变之前，端粒平均缩短至端粒/亚端粒接头处1.2 kb处，随后在细胞中通过体细胞端粒酶介导的约2.5 kb延长。同时，研究还发现了端粒中以非端粒酶依赖方式产生的体细胞缺失。该结果揭示了影响COLO829端粒的端粒酶依赖性和非依赖性突变模式，虽然COLO829端粒比COLO829BL的更短，但这并不代表其端粒被持续损伤，而是指在癌症发生前经历了渐进性的端粒缩短，随后由端粒酶介导的延长，并最终维持在稳态水平。

图6.体细胞突变对表观基因组的影响。

该研究在全基因组范围内构建了一个近T2T的二倍体组装，并将其与来自同一供体的黑色素瘤样本进行数据配对，最终能够无偏倚地以核苷酸分辨率分析几乎整个二倍体基因组中的体细胞突变，包括GRCh38中缺失的序列。研究阐明了体细胞突变和表观遗传改变如何在肿瘤发生过程中影响基因组结构与功能，为未来癌症发生及体细胞突变的表征提供了新的标准。

原文信息：

Min-Hwan Sohn, Danilo Dubocanin, Mitchell R. Vollger, et al. A telomere-to-telomere map of somatic mutation burden and functional impact in a cancer. Cell, 2026. DOI: 10.1016/j.cell.2026.09.033

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