江苏
近期我的课题进入RNA 蛋白互作的研究阶段，实验却屡屡碰壁，多次重复实验后依旧无法获得理想的实验结果。WB结果显示，Input样本条带完整清晰，说明蛋白样本提取、抗体、转膜曝光等步骤都不存在问题；探针也经过电泳验证，完整性达标。可偏偏pull down的结果飘忽不定，时而阴性对照冒出杂带，时而实验组完全没有信号，得到的数据模棱两可，根本不敢用于后续分析，一次次重复实验也耗费了不少组织样本以及实验时间，课题进度被拖慢了很久。
最开始着手开展RNA pull down实验时，我查阅了大量相关文献，发现很多研究都选用赛默飞的RNA pull down试剂盒。当时便想着众多文献都使用这款试剂盒，踩坑的概率应该很小，于是在实验开展时便采购了这套试剂盒。真正上手之后才体会到，这套体系更加适配细胞样本，试剂盒只提供磁珠、标记试剂和基础缓冲液，处理组织样本所需的裂解液、蛋白酶抑制剂都需要我们另行采购搭配。而我的实验很大一部分是肠道组织样本，组织离体之后蛋白酶激活速度非常快，操作不当很容易造成蛋白降解。有好几次实验都出现裂解完立刻分出的Input样本条带完好，但是经过孵育、洗涤一整套流程之后，pull down洗脱产物里目的蛋白直接消失的情况。为解决这些问题，我又进行了多次条件优化，但始终无法获得稳定的实验结果，后续在其他课题组师姐的推荐下我试用了BIOG RNA pull down试剂盒。
拿到试剂盒后我先查看了说明书，确保该试剂盒完整包含组织样本的处理流程，便开始了正式实验。正式实验时我设置了空白组、目标RNA探针实验组、突变探针阴性对照组，并根据说明书的建议同步收集pull down洗脱产物（图1A）与孵育结束之后的上清液（图1B）进行WB检测。最终WB结果可以看到：pull down产物中，只有目标RNA探针组出现了特异性目的条带；空白组以及突变序列阴性对照组没有出现条带，几乎不存在非特异性的杂信号。孵育结束之后的上清液样本中，空白组与突变对照组的蛋白条带很强；而目标RNA探针组上清中该蛋白的信号明显减弱，说明相当一部分目的蛋白已经被目标RNA特异性富集。为验证结果的可靠性，我一共完成三次独立生物学重复，每一次都可以稳定复现该趋势，后续大批量样本检测也都顺利拿到预期结果。
一整个实验操作下来，能感受到这套试剂盒确实针对pull down常见的实验痛点做了优化。这款试剂盒不像赛默飞的RNA pull down试剂盒中不含蛋白酶抑制剂，或者罗氏、MCE中仅包含抑制六种蛋白酶的复合蛋白酶抑制剂，它内置预混好的可抑制七种蛋白酶的复合蛋白酶抑制剂，很好解决了之前长时间孵育过程中蛋白被水解降解的难题，此外磁珠对生物素标记RNA探针的结合效率也不错，整套试剂配置完整，不需要分开采购多家厂商的试剂，减少了不同来源试剂混用带来的体系波动。总的来说，是一款性价比极高的试剂盒。如果大家经常做RNA pull down实验，也反复被蛋白降解、试剂体系难以协调、磁珠结合效率不高等问题困扰，不妨可以尝一试百代的这款试剂盒。
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