PNAS丨Kinetics-seq绘制体内单细胞RNA动力学图谱并揭示肿瘤细胞动态异质性

单细胞RNA测序能够识别组织中不同细胞类型并观察它们各自表达了哪些基因。然而，一次测序所得到的RNA丰度，主要反映的是采样时的细胞状态。但是，一个基因的RNA既在不断产生，也在不断降解：即使两个细胞中它的RNA总量相近，背后的合成与降解过程也可能截然不同【1】。要理解肿瘤细胞如何生长和适应环境，仅观察RNA“有多少”还不够，还需要了解它们“如何变化”。RNA代谢标记可以帮助研究人员区分新近合成的RNA与原有RNA，但在结构复杂、细胞类型多样的活体组织中，同时解析大量单细胞的RNA丰度、合成和降解过程，仍具有挑战性【2】。如何为体内肿瘤组织建立单细胞水平的RNA动力学图谱？

近日， 厦门大学杨朝勇教授团队，华东理工大学尹坤副研究员和上海交通大学医学院副研究员宋佳等研究人员在PNAS发表题为Kinetics-seqenables comprehensive profiling of single-cell RNA kinetics in vivo to reveal dynamic tumor heterogeneity的研究论文。该研究建立了Kinetics-seq方法，将体内RNA代谢标记与单细胞测序相结合，在区分新生RNA和已有RNA的基础上估计RNA合成、降解等动力学特征。研究人员将其应用于肾透明细胞癌小鼠模型，揭示了肿瘤及免疫细胞内部的动态差异，并发现基于RNA动力学筛选的基因程序与肿瘤进展密切相关。

研究人员首先在小鼠中使用4-硫代尿苷（4sU）标记一定时间内新产生的RNA，再获取组织中的细胞进行单细胞测序；经过碘乙酰胺化学处理后，新生RNA会产生可由测序识别的特征性T-to-C转换，从而与标记前已存在的RNA区分开来[3]；接着结合新、旧RNA信息，利用动力学模型估计不同基因的RNA周转、合成与降解特征。

研究团队在肾透明细胞癌小鼠模型的多个肿瘤发展阶段应用这一方法，共获得59,891个高质量细胞的数据。除了肿瘤细胞，图谱还涵盖肾脏细胞和肿瘤相关巨噬细胞等群体。方法评估显示，标记样本的T-to-C转换信号明显高于未标记对照；独立数据的比较也支持了所估计RNA稳定性趋势的可靠性。这使研究人员能够在复杂组织中观察：不同细胞不仅拥有不同的表达谱，也以不同方式更新自己的RNA。

作者首先发现在肿瘤免疫微环境中存在这种动态差异。作者将肿瘤相关巨噬细胞进一步划分为炎症型、调节型、增殖型和干扰素活化型，并发现在同一类巨噬细胞内部，RNA周转活跃程度仍有差别。例如，在炎症型巨噬细胞中，周转较高的细胞呈现更突出的抗原加工与呈递相关特征。由此可见，仅凭已有的细胞类型标签，仍可能遗漏群体内部的活动状态。

肿瘤细胞内部同样存在多种RNA调控方式。作者结合RNA合成和降解特征发现，一些基因呈现较快的合成与降解过程，其功能涉及细胞应激、增殖和抗原呈递等。进一步分析表明，具有免疫调节、增殖或代谢适应特征的肿瘤细胞，分别对应不同的RNA动力学模式。

即便在同一种肿瘤细胞亚型内部，合成活跃程度也并不一致。研究团队依据整体RNA合成特征区分出相对高、低合成状态：高合成状态更多关联细胞周期、DNA复制和RNA加工，低合成状态则更多关联代谢及组织结构相关过程。相比之下，这些状态在常规RNA丰度分析中并不容易清晰区分。RNA动力学因此为认识肿瘤异质性提供了表达量之外的另一层信息。

此外，RNA动力学还可以从既有通路基因集中寻找与肿瘤进展相关的活跃基因。研究团队分别依据RNA总量和估计的合成速率筛选基因，发现后者筛选出的部分基因程序，在小鼠肿瘤发展的不同阶段呈现更明显的变化，涉及PI3K–AKT–mTOR信号、上皮间质转化等过程。对公开的TCGA肾透明细胞癌队列进行分析后，作者还观察到，相关基因特征与患者总体生存存在关联。这些结果为进一步研究候选基因的作用提供了线索。

总体而言，Kinetics-seq将体内RNA标记、单细胞测序与动力学分析相结合，让研究人员得以从RNA的产生与消失两个方向观察复杂组织。它揭示了肿瘤细胞和免疫细胞中不易从RNA总量辨认的差异，也为筛选与疾病进展相关的活跃基因程序提供了新途径。

Shanshan Zhang，Yiling Xu，Rui Cheng和Zhong Zheng为论文的共同第一作者。Jia Song、Kun Yin和Chaoyong Yang为共同通讯作者。本研究由厦门大学、上海交通大学医学院和上海大学等单位的研究人员合作完成。

原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2534052123

制版人：十一

参考文献

[1] Battich N, et al. Sequencing metabolically labeled transcripts in single cells reveals mRNA turnover strategies.Science. 2020;367:1151–1156.

[2] Yin K, et al. Dyna-vivo-seq unveils cellular RNA dynamics during acute kidney injury via in vivo metabolic RNA labeling-based scRNA-seq.Nature Communications.2024;15:9866.

[3] Herzog VA, et al. Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.Nature Methods.2017;14:1198–1204.

学术合作组织

（*排名不分先后）

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