《食品科学》：河南农业大学黄现青教授、沈玥讲师等：槐米多酚抑制大肠杆菌的机理分析

食源性致病性大肠杆菌（Escherichia coli）是常见的病原体，也是导致食源性疾病的主要致病菌之一，每年引发超过1.6亿 例痢疾和100万 例死亡。致病性大肠杆菌具有较强的适应性，能够在不同的食品基质和环境条件下存活，这使得食品生产的各个环节都存在被污染的风险。当人体摄入被致病性大肠杆菌污染的食品后，致病菌株可能引发人体多种疾病综合症。目前，加热和化学试剂是灭活食品中致病性大肠杆菌的主要方法。但是，加热会破坏食品的营养成分与品质，降低其食用价值；化学试剂则可能造成残留问题。这些局限性促使研究人员寻找更安全、经济的替代策略。因此，开发新型天然、安全且经济的抑菌方法具有重要意义。

天然抗菌剂，尤其是从植物中提取的富含多酚化合物的抗菌剂，近年来备受关注。多酚类物质不仅具有抗氧化、抗炎等生理活性，还能通过破坏细菌细胞膜、改变膜通透性及细菌形状等方式实现抑菌作用。槐米（FSI）作为药食同源食品，因其富含多酚类成分而成为近年来的研究热点。槐米是槐树未开放的干花芽，含有多种多酚成分，包括芦丁、槲皮素、山柰酚、染料木黄酮等。目前，对槐米多酚的研究大多集中在提取工艺或单体成分的抑菌效果方面，例如提取工艺的优化，从槐米多酚中提取出某些成分如黄酮苷、芦丁。祖晓宁等研究发现槐米中的芦丁（含量为19.11 mg/g）粗提物对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为0.5 g/mL，最小杀菌浓度（MBC）为1 g/mL。程忠等研究发现以槐米提取物为原料，采用绿色合成法制备的氧化锌纳米粒子对大肠杆菌有明显的抗菌效果，其MIC为0.25 g/L。上述研究已表明槐米多酚中的某些提取物具有良好的抑菌性，但关于槐米多酚提取物的综合抑菌效果及机制研究目前仍较少。

河南农业大学食品科学技术学院的黑俊肖、黄现青*、沈玥*等以非致病性大肠杆菌ATCC 25922（抑菌模式菌株）为模型，构建多层次研究体系，旨在探究槐米多酚提取物对大肠杆菌ATCC 25922的抑菌活性及其多靶点作用机制。首先，通过高效液相色谱（HPLC）定量分析多酚成分及其含量，明确其活性基础；其次，评估提取物对大肠杆菌的抑菌活性（包括MIC、MBC和时间-杀菌曲线）；最后，从细菌结构（细胞壁、细胞膜和微观结构）、功能（物质代谢和氧化应激）和分子层面（自由能和分子对接）等多维度解析其抑菌机制。本研究旨在为阐明槐米多酚提取物对致病性大肠杆菌的抑菌机制奠定基础，并为天然抑菌剂开发提供理论依据，推动槐米多酚在食品保鲜领域的应用。

1 HPLC测定槐米多酚提取物

如图1和表1所示，HPLC共检测出槐米多酚提取物10 种，包括隐绿原酸、儿茶素、芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香苷、水仙苷、槲皮苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素。芦丁是槐米多酚中最主要的成分，含量为（136.291±0.433）mg/g；其次是槲皮素，含量为（32.396±0.470）mg/g。已有研究表明，槐米中的芦丁和槲皮素粗提物具有较好的抑菌效果，因此，可推断出槐米多酚提取物也可能表现出显著的抑菌活性。

2.2 槐米多酚提取物对大肠杆菌的抑菌活性

2.1 MIC和MBC

如表2所示，槐米多酚提取物在100.00 mg/mL质量浓度下完全灭活了大肠杆菌；在12.50 mg/mL质量浓度下显著降低了大肠杆菌的菌落数（P＜0.05）。然而，在最高质量浓度槐米多酚提取物（100 mg/mL）对应的乙醇对照组（乙醇体积分数为25%）中，菌落数为（8.035±0.016）（lg（CFU/mL））；在次高质量浓度槐米多酚提取物（50.00 mg/mL）对应的乙醇对照组（乙醇体积分数为12.50%）中，菌落数与空白对照组无显著差异（P＞0.05）。这表明在本实验条件下，溶剂乙醇并不是导致细菌完全灭活的主要因素，抑菌活性主要来源于槐米多酚本身。因此，可确定槐米多酚提取物对大肠杆菌的MIC和MBC分别为12.5 mg/mL和100 mg/mL。

2.2 时间-杀菌曲线的测定

如图2A所示，不同质量浓度的槐米多酚提取物均对大肠杆菌具有显著的抑制活性（P＜0.05）。在MIC和2 MIC条件下，大肠杆菌菌落数在2 h内显著下降，随后开始缓慢增加，直至8 h趋于稳定。当质量浓度提高至4 MIC和MBC时，大肠杆菌菌落数在2 h时显著下降，后续持续下降至检测限以下。

3 槐米多酚提取物对大肠杆菌结构的影响

3.1 槐米多酚提取物对细胞壁、细胞膜通透性和完整性的影响

如图2B所示，经槐米多酚提取物处理后，大肠杆菌菌悬液中AKP活性显著升高（P＜0.05），且活性随提取物浓度增加而逐渐增强，在MIC、2 MIC及4 MIC条件下，AKP活性分别为（0.04±0.02）、（0.18±0.02）、（0.33±0.01）U/mL。

如图2C所示，经MIC、2 MIC和4 MIC槐米多酚提取物处理后，细胞外β-半乳糖苷酶活性显著增加（P＜0.05），且随提取物质量浓度增加而逐渐增强，分别为2.05±0.02、2.66±0.03、3.43±0.07。

PI可以与受损或死亡细胞的DNA双螺旋结合，产生红色荧光。如图2D所示，未经槐米多酚提取物处理的大肠杆菌在明场下分散均匀、菌体呈杆状且大小相近。经槐米多酚提取物处理后，大肠杆菌分散不均匀，虽然仍保持杆状形态，但部分菌体变小。PI染色结果显示，随着槐米多酚提取物质量浓度增加，红色荧光细菌数量占比增加，表明槐米多酚导致细菌的细胞膜受损程度不断提高。为客观评价PI染色情况，排除主观因素干扰，对荧光强度进行了定量测定。如图2E所示，PI染色荧光强度随槐米多酚提取物质量浓度增加而显著增强。

如图2F所示，随着槐米多酚提取物质量浓度的增加，菌悬液的平均粒径Z不断减小。大肠杆菌的Zeta电位结果如图2G所示。当槐米多酚提取物质量浓度为MIC时，Zeta电位绝对值最大，为（20.30±0.68）mV。在2 MIC和4 MIC条件下，Zeta电位绝对值逐渐降低。特别是在2 MIC下细菌的活性显著降低，大量死亡，导致Zeta电位绝对值进一步减小。

如图2H所示，经槐米多酚提取物处理后的大肠杆菌胞外蛋白质量浓度较对照组显著升高（P＜0.05）。当槐米多酚提取物质量浓度为MIC时，胞外蛋白质量浓度最高，为（4 991.20±110.49）μg/mL；而在高质量浓度（2 MIC和4 MIC）处理时，胞外蛋白质量浓度与MIC无显著差异（P＞0.05）。

3.2 槐米多酚提取物对大肠杆菌形态的影响

如图3所示，CK组大肠杆菌细胞呈杆状，表面完整且分散均匀。经槐米多酚提取物处理后，大肠杆菌出现明显聚集和皱缩现象。在MIC和2 MIC浓度下，虽然2 MIC组菌落数未继续下降，但2 MIC组的细胞聚集较MIC组更为明显，且大肠杆菌表面凹陷和外漏物显著增多。这表明2 MIC浓度下的细胞聚集和结构破损加剧，与Zeta电位的结果相印证（图2G）。此外，4 MIC组的大肠杆菌皱缩更为显著，表面出现凹陷，内容物泄漏加剧。

4 槐米多酚提取物对大肠杆菌功能的影响

4.1 槐米多酚提取物对大肠杆菌物质代谢的影响

不同类型的抗生素涉及多种代谢活动，通过添加不同亚抑制浓度的抗生素，分析同一质量浓度的槐米多酚提取物对大肠杆菌的影响。通过测定不同浓度抗生素处理大肠杆菌的生长曲线（图4）和菌落数（表3），确定大肠杆菌亚抑制浓度（最佳的抗生素添加质量浓度），即经抗生素处理后大肠杆菌菌落数未显著降低的最大质量浓度，分别为：氯霉素0.39 μg/mL、萘啶酮酸12.50 μg/mL、利福平0.39 μg/mL、D-环丝氨酸25.00 μg/mL和链霉素6.25 μg/mL。

在抗生素亚抑制浓度下，经槐米多酚提取物处理2 h后，改变了大肠杆菌的存活率，结果如表4所示。在没有经过槐米多酚处理时（CK组），不添加抗生素和添加抗生素处理对细菌的菌落数无显著差异，说明所选择的抗生素浓度对大肠杆菌生长无影响。而在槐米多酚MIC条件下，含有链霉素和利福平的培养基中，大肠杆菌的菌落数显著降低（P＜0.05）。在槐米多酚2 MIC条件下，含有链霉素的培养基中，大肠杆菌的菌落数较不添加抗生素时显著降低（P＜0.05）。在槐米多酚4 MIC条件下，含有氯霉素、利福平和D-环丝氨酸的培养基中，大肠杆菌的菌落数比不添加抗生素时显著降低（P＜0.05）。

4.2 槐米多酚提取物对大肠杆菌氧化应激的影响

槐米多酚提取物对细胞内ROS水平的影响如图5A所示。结果表明，槐米多酚能显著干扰大肠杆菌的氧化还原平衡。当槐米多酚提取物质量浓度为MIC时，与CK组相比，其ROS水平无显著差异（P＞0.05）。然而，当槐米多酚提取物质量浓度增至2 MIC和4 MIC时，其ROS水平显著高于对照组，并随槐米多酚提取物质量浓度增加而持续上升。

为排除细菌数量差异的干扰，通过计算ROS相对水平（ROS荧光强度与菌落数的比值），可以更准确地分析单个细菌产生ROS的能力。如图5B所示，在MIC条件下，细菌未因槐米多酚产生额外ROS，与图5A结果一致。而在2 MIC和4 MIC条件下，细胞内ROS相对水平显著提高。

如图5C所示，与CK组相比，3 个槐米多酚提取物处理组（MIC、2 MIC、4 MIC）的大肠杆菌胞外MDA浓度均显著增加（P＜0.05），且具有浓度依赖性。

5 槐米多酚提取物作用大肠杆菌的潜在蛋白靶点

通过生物信息学、结合能和分子对接技术，从分子层面分析槐米多酚成分与大肠杆菌关键蛋白靶点的相互作用。如表5所示，槐米多酚类化合物在大肠杆菌的潜在作用靶点包括3-羟基酰基-ACP脱水酶（fabZ）、2,5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶A（dkgA）和DNA结合转录抑制因子（acrR）。根据结合能理论，当结合能＜0 kcal/mol时，配体和受体就能自发结合，并且结合能越低表示亲和力越强。结合能分析结果表明，fabZ和隐绿原酸的结合能最低，为-5.98 kcal/mol，acrR和儿茶素的结合能最低，为-5.31 kcal/mol，dkgA和异鼠李素的结合能最低，为-7.86 kcal/mol。

氢键的长度是影响分子间结合能的重要因素，键长越短，结合能越低。槐米多酚活性成分与蛋白靶点的可视化分子对接图如图6所示，山柰酚与fabZ口袋中的GLU-80、ASN-81、ASP-144形成的氢键长度均小于2.2 Å；儿茶素与acrR口袋中的SER-137、GLU-74形成的氢键长度均小于2.2 Å；异鼠李素与dkgA口袋中的SER-187形成的氢键长度小于2.2 Å，说明上述活性成分与对应蛋白间的结合能较低。

3 讨 论

3.1 槐米多酚提取物的化学组成

本研究通过HPLC定量分析，系统鉴定了槐米多酚提取物中的10 种多酚成分，其中芦丁是提取物最主要的成分（136.291 mg/g）。这一组成特征与Li Jun等的研究结论一致。值得注意的是，虽然芦丁本身的抑菌活性已被证实，但本研究中槐米多酚提取物对大肠杆菌的抑菌效能（MIC为0.012 5 g/mL）显著优于祖晓宁等报道的芦丁粗提物（MIC为0.5 g/mL）。这一差异表明，槐米提取物中其他多酚成分可能发挥了增效作用。

后续分子对接结果为此提供了分子层面的解释。芦丁与关键靶点蛋白（fabZ、acrR、dkgA）的结合能范围为-2.23～-3.97 kcal/mol，而隐绿原酸、儿茶素、槲皮素、山柰酚及异鼠李素等成分与相应靶点的结合能更低（例如，儿茶素与acrR的结合能为-5.31 kcal/mol，异鼠李素与dkgA的结合能为-7.86 kcal/mol）。这表明，尽管芦丁含量最高，但提取物的显著抑菌活性可能源于多种多酚成分的共同作用。其中某些低含量成分通过与关键靶点更强的结合，在诱导氧化应激或降低细菌抗性等关键途径中发挥重要增效作用。后续研究可通过比较单一成分与复合成分的抑菌活性，进一步验证各成分间的相互作用关系。

3.2 槐米多酚提取物的抑菌效果

时间-杀菌动力学曲线显示槐米多酚提取物呈现浓度依赖性特征。在MIC及2 MIC条件下，槐米多酚提取物处理能有效抑制细菌生长但未能完全杀灭，细菌数量在初期下降后进入平台期。这种现象可能由于该浓度下的抑菌剂无法完全阻断细菌修复；而在4 MIC及MBC条件下，槐米多酚提取物表现出显著的杀菌效果。这表明在更高质量浓度下，槐米多酚提取物能够充分激活对细菌的致命损伤机制。这种不同效应的转变，表明不同质量浓度下可能存在主导作用机制的差异。

本研究测得的槐米多酚提取物MIC（12.5 mg/mL）虽高于部分化学防腐剂（如4 g/kg苯甲酸钠对大肠杆菌的抑菌率为（66.39±2.51）%），但与常见天然抑菌剂的效果相当，例如来源于不同植物的花青素提取物对大肠杆菌的MIC为10～40 mg/mL。这表明直接将槐米多酚粗提物作为单一防腐剂应用于食品体系，可能面临高浓度多酚应用到食品中的实际挑战。因此，在实际应用中，可通过以下方式降低所需有效浓度：优化提取工艺以富集活性成分、将其作为辅助抑菌剂与其他天然保鲜技术（如低温或气调包装）联合使用，或应用于对天然标签有要求的高附加值食品体系。未来研究仍需要在真实食品基质中验证其保鲜效果及最佳应用浓度范围。

3.3 槐米多酚通过破坏细胞结构、干扰代谢与诱导氧化应激发挥抑菌作用

研究结果显示，槐米多酚提取物能同时破坏大肠杆菌的细胞壁和细胞膜。AKP位于细菌细胞壁和细胞膜之间。当细胞壁受损时，细菌内的AKP会泄漏到细胞外。AKP活性的显著升高直接证实了细胞壁完整性的破坏。

此外，β-半乳糖苷酶活性的显著增加和PI摄入量的增多直接表明细胞膜的通透性和完整性也受到明显破坏。这些发现与多种植物多酚类物质的已知作用机制一致，即通过干扰细菌膜脂双分子层或与膜蛋白相互作用来破坏其功能。

通过测定Zeta电位和粒径来评估细菌细胞膜的状态及细胞大小，从而量化膜稳定性。在膜损伤过程中，菌体的Zeta电位和平均粒径呈现规律性变化。在MIC浓度下，Zeta电位的负电性增强，这可能是由于细胞膜受损导致胞内物质泄漏；而在更高质量浓度（2MIC和4MIC）时，负电性减弱，这可能是由于细胞膜受损加剧导致胞内物质泄漏后在细胞外重新聚集。同时，平均粒径的减小间接支持了细胞膜受损导致内容物损失、菌体缩小并改变细菌聚集度的推断。

SEM观察到的菌体内容物泄漏现象，从形态学上直观地证实了细胞壁与细胞膜双重屏障的失效。

通过测定胞外蛋白浓度进一步间接评估细胞膜的完整性。结果表明，在MIC浓度时，膜损伤导致胞内蛋白大量泄漏。然而，在2MIC和4MIC浓度水平下，胞外蛋白质量浓度未继续升高。如前所述，细胞膜损伤并未停止，因此，这可能是由于高浓度多酚抑制了蛋白质合成。2.4.1节中对抗生素敏感性的变化结果证实了蛋白质合成的抑制。这表明在较高质量浓度下，槐米多酚可能同时具有破坏细胞结构和抑制代谢合成的多重作用。

在破坏结构屏障的基础上，槐米多酚提取物进一步干扰了细菌的核心代谢功能。抗生素敏感性增强实验为此提供了关键证据。氯霉素、利福平、D-环丝氨酸、链霉素和萘啶酮酸分别抑制细菌细胞的蛋白质合成、RNA合成、肽聚糖合成、脂质与蛋白质合成及DNA合成。在槐米多酚MIC条件下，大肠杆菌对靶向RNA合成（利福平）及脂质和蛋白质合成（链霉素）的抗生素敏感性显著增强；在2 MIC条件下，对靶向脂质和蛋白质合成（链霉素）的抗生素敏感性显著增强；在4 MIC条件下，对靶向脂质和蛋白质合成（氯霉素）、RNA合成（利福平）以及肽聚糖合成（D-环丝氨酸）的抗生素敏感性显著增强，这表明提取物可能同时扰乱了这些关键生物合成途径。

此外，本研究还发现槐米多酚能破坏大肠杆菌的氧化还原稳态。CK组中细菌因营养竞争引发细胞应激，导致ROS水平升高。在MIC条件下，ROS水平和ROS相对水平与对照组相比未显著变化，但MDA浓度显著增加，表明膜脂过氧化可能源于多酚的直接作用或其对抗氧化系统的干扰。结合前述菌落数显著降低的结果表明，在MIC浓度下，ROS并非大肠杆菌的主要致死因素。而在2 MIC与4 MIC条件下，ROS水平和ROS相对水平显著增加，同时MDA进一步积累，表明强烈的内源性氧化应激已成为高浓度条件下的核心杀菌机制之一。过量ROS会攻击脂质、蛋白质和DNA，其中膜脂过氧化会加剧膜系统损伤，这与高浓度下观察到的更严重的膜损伤、形态破坏现象及菌落数结果完全相符。

3.4 基于分子对接的多靶点协同作用机制

分子对接研究从分子互作层面为上述宏观表型提供了潜在的解释。预测的3个关键靶点分别对应不同的抑菌环节。

fabZ是细菌脂肪酸生物合成途径中的关键酶。分子对接显示，隐绿原酸、山柰酚等成分与fabZ活性口袋具有强结合力（表5、图6A）。抑制fabZ可阻断细菌膜脂的合成，这为观察到的细胞膜结构破坏提供了直接的分子靶点依据。

dkgA属于醛酮还原酶（AKR）超家族，参与清除有毒的活性羰基化合物以维持氧化还原稳态。异鼠李素、儿茶素等与dkgA具有极低的结合能（表5、图6C），表明其可能有效抑制该酶的活性，进而破坏氧化还原稳态。这为高质量浓度槐米多酚提取物（2 MIC、4 MIC）处理下观察到的ROS和MDA浓度激增的现象提供了合理的分子靶点依据。

acrR影响细菌的抗性。儿茶素、槲皮素等成分与acrR的高亲和力结合（表5、图6B），可能削弱大肠杆菌的固有抗性。这解释了为何经槐米多酚处理后，细菌对多种抗生素的敏感性普遍增强。这些结果验证了前文的实验结论，并提供了具体的分子靶点。

3.5 槐米多酚提取物抑制大肠杆菌的机制

上述研究结果表明，槐米多酚提取物对大肠杆菌的抑菌机理是多途径协同作用。如图7所示，在MIC（低质量浓度）条件下，槐米多酚提取物主要通过多组分共同作用靶向大肠杆菌fabZ和acrR蛋白，破坏细胞壁和细胞膜及细菌抗性，抑制细菌RNA、脂肪和蛋白质合成，从而进一步导致脂质代谢受损和细胞膜结构破坏，最终导致细菌死亡。在2 MIC和4 MIC（高质量浓度）条件下，槐米多酚主要通过靶向大肠杆菌dkgA蛋白诱导大肠杆菌产生大量ROS和膜脂过氧化，抑制细菌的物质代谢（RNA、蛋白质、肽聚糖），进一步破坏细胞壁和细胞膜结构和功能，降低细菌的抗性，最终导致细菌快速死亡。

本研究在非致病标准模式菌株上阐明了槐米多酚抑菌机制，涉及细胞结构破坏、代谢干扰及氧化应激等多个保守途径，可为评估此类天然产物在控制食源性致病菌方面的应用潜力提供理论依据。

4 结 论

本研究系统探讨了槐米多酚提取物对大肠杆菌ATCC 25922的抑菌活性及其作用机制。结果显示，槐米多酚提取物含有10 种多酚成分，这些成分共同抑制大肠杆菌生长，其MIC为12.5 mg/mL、MBC为100 mg/mL，且抑制作用呈浓度依赖性。细胞结构分析、功能研究及分子对接实验表明，在低质量浓度（MIC）条件下，槐米多酚主要通过靶向大肠杆菌的fabZ和acrR蛋白，破坏细胞壁和细胞膜结构，降低细菌抗性，同时抑制RNA、脂肪和蛋白质合成，最终导致大肠杆菌死亡；在高质量浓度（2 MIC和4 MIC）条件下，槐米多酚则主要靶向dkgA蛋白，诱导细菌产生大量ROS和MDA，破坏膜结构和功能，并抑制RNA、蛋白质及肽聚糖合成，从而导致细菌死亡。本研究初步阐明了槐米多酚对大肠杆菌ATCC 25922的抑菌机制。需要指出的是，本研究主要基于体外实验模型和分子对接分析，未来研究需要在真实食品基质中验证槐米多酚提取物的保鲜效果，评估其对致病性大肠杆菌的抑菌活性，并通过基因敲除、蛋白质组学等技术在分子水平进一步验证其作用靶点和通路，推动实际应用。本研究可为多酚类天然抑菌剂的开发，以及槐米多酚在食品保鲜等领域的应用提供理论基础。

引文格式：

黑俊肖, 芦姝羽, 闫栋, 等. 槐米多酚抑制大肠杆菌的机理分析[J]. 食品科学, 2026, 47(12): 1-12. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20260106-040.

HEI Junxiao, LU Shuyu, YAN Dong, et al. Inhibition mechanism of Escherichia coli by polyphenols from Flos Sophorae Immaturus[J]. Food Science, 2026, 47(12): 1-12. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20260106-040.

实习编辑：刘芯；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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