江苏省中+南京中医药大学揭示宣痹消瘤方活性成分靶向多发性骨髓瘤中CREBBP/c-Myc轴缓解骨质破坏

✍导语

宣痹消瘤方（XBXLF），具有 “扶正祛毒、化瘀散结”功效。由八味药材组成：黄芪、菟丝子、白花蛇舌草、黄芩、土茯苓、黄蜀葵花、莪术和当归。多发性骨髓瘤（MM）是第二大血液系统恶性肿瘤，超过 80%患者会并发骨髓瘤骨病（MBD），其特征为骨质溶解性病变和预后不良。一篇发表于Phytomedicine（IF：11.3）的研究揭示了宣痹消瘤方能通过皂苷类药物靶向多发性骨髓瘤中的CREBBP/c-Myc轴，从而缓解骨质破坏。

PART 01

题目及作者信息

PART 02

️文献摘要：

⌛一图概括

【目的】

阐明宣痹消瘤方对多发性骨髓瘤的药理作用，并重点关注其对骨病的治疗效果。

【方法】

采用一种综合方法，结合临床试验、体外和体内模型、血清药理化学、基于UPLC-MS/MS的代谢组学、单细胞RNA测序以及分子对接/CETSA检测。使用KMS28PE/CAG细胞系和RAW264.7破骨细胞生成模型，通过含有XBXLF的血清或其鉴定成分进行处理，以研究其潜在机制。

【结果】在伴有骨髓增生异常综合征（MBD）的骨髓增生异常综合征（MM）患者中，添加XBXLF治疗显著改善了生存率和生活质量，同时减少了不良事件和骨痛标志物。在小鼠模型中，XBXLF抑制了骨质流失和破骨细胞生成，并促进了成骨细胞活性。在机制上，含有XBXLF代谢物的血清剂量依赖性地抑制了MM细胞增殖和破骨细胞形成。RNA-seq分析鉴定出CREBBP下调是关键事件。在XBXLF给药后，鉴定出皂苷和3-羟基肉桂酸为主要的循环生物活性成分。重要的是，皂苷直接结合CREBBP并下调c-Myc，从而抑制了MM细胞增殖和破骨细胞分化。

【结论】

研究表明，通过其活性成分皂苷元，XBXLF通过调节CREBBP/c-Myc通路改善了MBD。这些发现揭示了一种治疗MBD的新策略，并为将XBXLF纳入多发性骨髓瘤联合治疗方案提供了科学依据。

PART 03

研究思路与方法

研究思路：前瞻性临床观察→动物体内药效→单细胞测序解析骨髓微环境→含药血清体外细胞功能→UPLC‑MS/MS 血清代谢组筛选入血活性成分→分子对接 + CETSA 靶点验证→siRNA 基因敲低回补实验确认通路

引物序列：

Primer

Foward primer

Reverse primer

IFN-γ

GAGTGTGGAGACCATCAAGGAAG

GGCGACAGTTCAGCCATCAC

TNF-α

AGCCCATGTTGTAGCAAACC

TGAGGTACAGGCCCTCTGAT

β-actin

CATGTACGTTGCTATCCAGGC

TCTCCTTAATGTCACGCACGATCACGCACGAT

c-Myc

CCTACCCTCTCAACGACAGC

CTCTGACCTTTTGCCAGGAG

CREBBP

TGGAGGCGGCAAGAACAAGAC

GGCGGCGGCTCTTGTCTAT

ACP5

GCGACCATTGTTAGCCACATACG

CGTTGATGTCGCACAGAGGGAT

STCK

AGCAGAACGGAGGCATTGACTC

CCCTCTGCATTTAGCTGCCTTTG

MMP9

GCTGACTACGATAAGGACGGCA

TAGTGGTGCAGGCAGAGTAGGA

TMTSF4

TTTGCCGCTGTGGACTATCTGC

GCAGAATCATGGACGACTCCTTG

GAPDH

CATCACTGCCACCCAGAAGACTG

ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG

PART 04

核心亮点

• XBXLF联合硼替佐米能延长多发性骨髓瘤和骨病患者的无进展生存期，并缓解骨质破坏。

• XBXLF抑制了多发性骨髓瘤细胞的增殖和破骨细胞的分化，体外和体内均如此。

• 皂草苷被鉴定为XBLF的关键循环生物活性成分，并直接与表观遗传调节因子CREBBP结合。

• XBXLF通过皂草苷抑制多发性骨髓瘤中的增殖和破骨细胞生成，其作用机制是通过下调CREBBP/c-Myc信号轴。

PART 05

研究结果

图1：XBXLF联合BTZ可改善伴有MBD的MM患者的生存率和生活质量

(A)新诊断MM患者中XBXLF联合BTZ（n = 50）与对照组（Ctrl，仅BTZ，n = 41）的临床反应。CR，完全缓解；VGPR，非常好的部分缓解；PR，部分缓解；SD，疾病稳定；PD，疾病进展。 (B)采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析了Ctrl（n = 41）和XBXLF（n = 48）治疗组MM患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）率。 (C)XBXLF显著减轻了与MM相关的中医症状，包括瘀（Yu）、热（Re）、痰（Tan）、虚（Xu）、睡眠和饮食。 (D) XBXLF组的MM患者与Ctrl组相比，不良反应（包括胃肠道反应、肺部感染、皮肤等）较少。 (E-H) XBXLF治疗显著改善了骨质破坏，与基线和对照组相比（每组n = 23），如Karnofsky功能状态评分所示。（E），疼痛数值评分（F），以及骨代谢标志物NT-proOC（G）和β-CTX（H）。数据表示为平均值±标准差。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, n.s. 表示无显著差异。

图2：XBXLF改善多发性骨髓瘤小鼠模型中的骨质流失和肿瘤负荷

(A)NOD/SCID-TIBIA模型的示意图。小鼠通过胫骨内注射1 × 105 MM.1S细胞，并用PBS或XBXLF（14.6 g/kg）处理四周（n = 3）。(B) Ctrl组和XBXLF组胫骨的代表性微CT图像。(C) NOD-SCID TIBIA小鼠胫骨的平均骨矿物质密度（BMD）定量分析，包括有无XBXLF处理的情况。(D) 血钙水平使用比色试剂盒进行测量。(E) NOD/SCID-TIBIA模型小鼠胫骨切片的H&E染色和TRAP染色的代表性图像。数据表示为平均值±标准差。***P < 0.001。

图3：单细胞RNA测序鉴定出XBXLF在调节破骨细胞分化和NK细胞细胞毒性中的双重作用

(A) UMAP（均匀流形近似与投影）可视化显示了两个组中识别出的18种细胞类型。细胞仅基于聚类注释进行着色。 (B) t-SNE（t分布随机邻域嵌入）图，单细胞转录组按细胞类型聚类着色。 (C) 条形图显示了Ctrl组和XBXLF组中每种细胞类型的百分比（%），突出显示了免疫相关的NK细胞、巨噬细胞（红色）以及B细胞和多能细胞（单核细胞祖细胞、HSC）（蓝色）。 (D-E)KEGG分析显示，中性粒细胞和巨噬细胞中富集的20条通路中，突出了破骨细胞分化和NK细胞介导的细胞毒性。(F)XBXLF细胞簇与Ctrl细胞簇之间存在显著的配体-受体通讯信号，其中NK细胞和B细胞簇的通讯概率最高，以红色高亮显示。

图4：含XBXLF的血清抑制多发性骨髓瘤细胞增殖和RAW264.7破骨细胞分化

(A)茜素红染色表明，与空白对照血清（Ctrl）相比，含XBXLF的血清可诱导骨髓间充质干细胞（BMSC）呈剂量依赖性地发生成骨细胞分化。比例尺：100 μm；n = 4。 (B)TRAP染色表明，含XBXLF的血清可抑制RAW264.7细胞呈剂量依赖性地发生破骨细胞分化。比例尺：200 μm；n = 4。 (C-D)CCK8测定显示，XBXLF血清对KMS28PE和CAG MM细胞系均具有显著抑制作用（> 7.5%）（每组n = 4）。 (E) RNA-seq 鉴定出 XBXLF 血清处理的 KMS28PE 和 CAG 细胞中分别有 2200 和 945 个差异表达基因（DEGs），与对照组相比。 (F) KEGG 分析显示，在 XBXLF 处理的 CAG 细胞中，破骨细胞分化和细胞周期是富集度最高的通路，其中包含 CREBBP 和 MYC 等关键差异表达基因。数据表示为平均值 ± 标准差。*P < 0.05, ***P < 0.001, n.s. 表示无显著差异。

图5：一种综合的化学与功能策略确定了萨波拉宁是MM中XBXLF的一种具有生物活性的血浆成分

(A)使用 UPLC-MS/MS 对 MM 患者治疗前后的血液样本进行代谢组学分析的流程图。 (B) 基于治疗前后血液样本（n = 3）的主成分分析（PCA）图。 (C) XBXLF 与不同血液样本组之间差异代谢物的维恩图。详细信息见 补充表 2。(D) 采用多反应监测（MRM）的代谢物峰的总离子色谱图（TIC）（N 表示负离子模式；P 表示正离子模式）。 (E) 热图显示了在 XBXLF-After、XBXLF-Before 和 XBXLF 组之间比较中鉴定出的代谢物的整体聚类情况。 (F) 对样本中聚类代谢物的 K-means 聚类分析。 (G) 火山图展示了差异表达的代谢物，绿色点表示下调的差异代谢物，红色点表示上调的差异代谢物，灰色点表示无显著（NS）差异。 (H) 从 XBXLF 中鉴定的生物活性成分的代表性化学结构和色谱图，显示了 3-羟基肉桂酸（IC50: KMS28PE 为 118.6 μM，CAG 为 72.00 μM）和皂苷素（IC50: 对MM细胞活力，KMS28PE为31.06 μM，CAG为10.42 μM)。(I) TRAP染色显示，Saponarin抑制了破骨细胞的分化，而3-羟基肉桂酸则没有（n = 3）。比例尺：200 μm。数据表示为平均值±标准差。

图6： XBXLF中的皂草苷靶向CREBBP抑制c-Myc轴并发挥抗多发性骨髓瘤活性

(A)RT-qPCR证实，在XBLF血清(10%)处理后，KMS28PE和CAG细胞中CREBBP mRNA水平下调(n = 3)。(B)Western blot检测到，与Ctrl或空白血清处理相比，XBLF处理后CREBBP蛋白水平降低。(C)分子对接显示，CREBBP (PDB: 5J0D)与Saponarin的相互作用比与3-羟基肉桂酸的相互作用更强。(D)CETSA证实Saponarin与CREBBP蛋白结合并增强其热稳定性。在CETSA实验中，α-Tubulin被用作内参，而非β-actin。(E) 单独使用Saponarin (5 μM) 处理下调了KMS28PE和CAG细胞中的CREBBP和c-Myc蛋白水平。 (F) CCK8分析显示，si-CREBBP加剧了XBXLF对MM细胞增殖的抑制作用。 (G) CCK8分析显示，si-CREBBP加剧了Saponarin对MM细胞增殖的抑制作用。 (H) TRAP染色表明，si-CREBBP加剧了XBXLF对RAW264.7细胞破骨细胞分化的抑制作用。比例尺：100 μm。数据表示为平均值 ± 标准差。*P < 0.05, ***P < 0.001.

图7：XBXLF中的皂草苷调节CREBBP/c-Myc轴以调控下游破骨细胞分化基因，从而改善骨破坏

(A)RT-qPCR检测了 CREBBP和 c-Myc在XBXLF血清处理后0 h、4 h、8 h两个MM细胞中的mRNA水平(n = 3)。(B)RT-qPCR检测了 CREBBP和 c-Myc在皂苷处理后0 h、4 h、8 h两个MM细胞中的mRNA水平。(C)Western blot检测了XBXLF血清处理后0 h、4 h、8 h、12 h两个MM细胞中的CREBBP和c-Myc蛋白水平。(D)Western blot检测了皂苷处理后0 h、4 h、8 h、12 h两个MM细胞中的CREBBP和c-Myc蛋白水平。(E) WB分析显示，XBXLF抑制了RAW264.7细胞中破骨细胞标志物（RANKL）、β-catenin和CREBBP/c-Myc轴蛋白的表达。 (F) RT-qPCR检测显示，XBXLF抑制了RAW264.7细胞中与破骨细胞分化相关的基因（ACP5、STCK、TMTSF4、MMP9）的表达。(G) 总结宣痹小柳方（XBXLF）多靶点作用的图示：通过Saponarin对肿瘤生长和破骨细胞生成通过CREBBP/c-Myc轴的双重抑制，缓解骨质破坏，从而改善骨病患者的生存率。数据表示为平均值±标准差。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, n.s.表示无显著差异。

PART 06

结论

XBXLF代表了多发性骨髓瘤治疗中的一项临床意义重大进展，因为它不仅提高了蛋白酶体抑制剂的疗效，还能积极逆转骨质破坏。活性成分Saponarin靶向CREBBP/c-Myc轴，发挥双重抗肿瘤和骨保护作用。这些发现凸显了XBXLF作为多发性骨髓瘤辅助治疗的转化即时性，尤其是在骨髓瘤相关骨病（MBD）中，并将基于中医药理念、靶向CREBBP的植物疗法定位为整合性管理浆细胞疾病的有力策略。

机制解析

宣痹消瘤方口服后，活性成分Saponarin吸收入血；

1.直接结合并抑制表观共激活因子CREBBP，下调下游癌基因c‑Myc；一方面抑制骨髓瘤细胞恶性增殖；

2.同时抑制破骨细胞分化，减轻骨吸收损伤；促进成骨；

3.重塑骨髓微环境，增强NK细胞抗肿瘤免疫；

三者协同，实现抑瘤、护骨、改善生存质量，在临床上联合硼替佐米提升疗效，降低毒副反应。

科研启示｜这篇文章值得我们借鉴的思路

1.完整的转化链条：临床→动物→细胞→入血物质→靶点确认。区别大量只做细胞动物无临床数据的中药文章；并且使用人血清代谢组，找真正体内暴露原型成分，而不是只拿复方中高含量体外成分做实验。

2.严谨靶点验证方式：不止分子对接，增加CETSA细胞热位移实验证明蛋白‑小分子直接相互作用，再加si‑RNA回补实验证明通路依赖，规避“仅靠对接就宣称直接靶点”常见缺陷。

3.抓住临床未被满足需求：针对骨髓瘤骨病MBD，做到抗肿瘤+骨保护双重作用，而不是只杀伤肿瘤；单细胞测序看到免疫微环境重塑，体现中药复方多靶点整体特点。

4.中医理论现代诠释：“扶正祛毒，化瘀除痹”，现代机制体现为抑制癌基因、保护骨稳态、重塑骨髓免疫微环境。

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