Nat Commun | 在实验结构之前“看见”三元复合物：VAV1分子胶降解剂的理性设计

靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation,TPD）通过劫持细胞内的泛素-蛋白酶体系统清除致病蛋白，为传统“不可成药”靶点提供了新思路。其中分子胶降解剂（molecular glue degrader）因分子量小、成药性好而备受关注。它们无需占据靶蛋白的活性口袋，只需诱导或稳定E3泛素连接酶与靶蛋白（新底物，neosubstrate）之间的蛋白-蛋白相互作用，把后者“粘”到降解机器上。以沙利度胺为代表的免疫调节药物（IMiDs）结合E3连接酶底物受体Cereblon（CRBN）、重塑其底物特异性并诱导IKZF1/IKZF3降解，是这一机制最成功的临床验证。

但分子胶的理性设计一直很困难。它的活性主要取决于能否把E3连接酶与靶蛋白撮合到一个恰当的相对位置上，与化合物自身同靶蛋白的结合强度关系不大。这种间接的作用机制，使得大量分子胶来自偶然发现或表型筛选，后续优化也主要依赖“合成—测活—总结经验”的循环。要打破这个循环，最需要的是三元复合物的结构。然而冷冻电镜与X射线晶体学通常要求高度优化的化合物和实验条件，三元复合物结构往往到项目后期才被解出，更多起到回顾性解释的作用，很难在最需要它的hit-to-lead阶段提供指导。于是问题变成：在实验结构尚不可得时，能否先构建出足够可靠的三元复合物模型，并用它来前瞻性地指导分子设计？

近日，美国贝勒医学院（Baylor College of Medicine）王津（Jin Wang）教授团队在Nature Communications上发表了文章Leveraging High-Throughput Proteomics and AI-Based Protein Folding to Accelerate VAV1 Molecular Glue Discovery，以造血系统特异性信号蛋白VAV1为例走通了这样一条路径：从无偏蛋白质组学筛选出发，先把识别元件定位到VAV1的SH3结构域，再用物理与AI结合的GluePlex流程预测三元复合物界面；定点突变由此确立了一个非经典RT-loop降解决定簇（RDxS基序）；随后以该模型为地图完成构象限制与构效关系优化，并用自由能计算实现对类似物活性的定量前瞻排序。这项工作试图把过去高度依赖筛选与经验的分子胶发现，推进为“筛选发现—结构解释—计算预测—药化优化”的可迭代闭环。

闭环的起点：一次不预设规则的筛选

VAV1是造血系统特异性表达的信号蛋白，既是Rho/Rac家族GTPase的鸟苷酸交换因子（GEF），又是一个衔接蛋白（adaptor），处于T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）信号通路的枢纽位置。它的突变或异常表达与T细胞淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤以及自身免疫病密切相关。由于其致病作用同时来自催化活性和骨架功能，传统抑制剂只能阻断其中一部分，把整个蛋白清除掉才可能同时终止两者，这也使VAV1成为TPD策略的理想靶点。

作者的做法是让细胞自己给出答案。借助Thermo Orbitrap Astral质谱平台，他们对一个以苯基戊二酰亚胺（phenyl-glutarimide）为核心骨架的CRBN分子胶化合物库开展高通量、定量的全局蛋白质组学筛选，从中同时得到两个结构高度相似的化合物：NGT-201-11（苯基取代）引起VAV1轻度但显著的下降，把苯基换成吲哚的NGT-201-12则展现出明显更强的降解。机制实验确认这是标准的分子胶降解：E1抑制剂、NEDD化抑制剂、蛋白酶体抑制剂与CRBN配体竞争均可挽救，CRBN敲除同样阻断降解，VAV1的mRNA水平不受影响。

识别元件找到了，但那里没有G-loop

有了先导化合物，下一步是弄清它如何把VAV1交给CRBN。作者用NanoLuc荧光素酶定量体系构建了一系列VAV1截短突变体，结果很清晰：删除C端的SH3结构域（SH3-2）足以且必须完全阻断降解，识别元件就在这个约60个氨基酸的结构域里。

问题随之出现。已报道的CRBN新底物大多通过一个称为G-loop的β-发夹结构（含保守甘氨酸）被识别，这一“经典范式”是目前预测新底物、解释选择性的主要依据。但VAV1的SH3-2上并不存在任何G-loop。已有的经验规则在这里失效，既说不清界面在哪，也无从判断该改分子的哪一部分。结构模型在此从“有帮助”变成了必需品。

GluePlex：用物理先验引导AI折叠

作者为此开发了一条基于开源工具的结构预测流程GluePlex。它的出发点是，分子胶诱导的新界面往往锚定在蛋白表面固有的几何形状与能量热点上。流程分三步：先用几何深度学习模型PeSTo分别预测CRBN与VAV1 SH3-2自由表面上的相互作用热点；再以这些热点作为生物学约束驱动HADDOCK蛋白-蛋白对接，生成多样化的二元复合物模板；最后以每个模板簇的代表构象为骨架，用Boltz-2进行带配体的模板化共折叠，让小分子在界面中实现精确的诱导契合定位。

在120个共折叠模型中，界面置信度最高的一簇给出了可检验的原子级假说（ipTM = 0.94）：NGT-201-12的戊二酰亚胺端占据CRBN的经典IMiD口袋，吲哚环朝外伸出，与VAV1 SH3-2表面形成复合界面，其中VAV1 R796与吲哚环之间形成阳离子-π相互作用；同时CRBN与SH3-2的RT loop（残基796–799）之间存在直接的蛋白-蛋白接触。

物理对接这一步是否多余？作者做了一组对照。对携带经典G-loop的靶点，即使不提供任何对接模板，单独的Boltz-2也能生成高置信度、低偏差的三元复合物，因为G-loop基序在AlphaFold类模型的训练数据中高度富集。但面对降解决定簇未知的靶点，没有先验的Boltz-2需要在整个构象空间里搜索，给出的置信度很低、结构偏差也很大。PeSTo与HADDOCK提供的物理约束在这里扮演的是先验的角色：把搜索范围收窄到正确答案附近的构象空间，让共折叠以更高的效率收敛。

图1. GluePlex流程与预测的 CRBN:NGT-201-12:VAV1 SH3-2 三元复合物界面

让模型接受检验：一个非经典的RDxS降解决定簇

作者随后对SH3-2上预测的界面残基做了系统的定点突变，用荧光素酶报告体系定量降解效率。结果与模型吻合：RT loop上的突变破坏性最强。核心RDxS基序中的R796A、D797A、S799A都导致降解活性丧失、剂量-效应关系消失；NanoBRET实验进一步显示，R796A突变体完全不能形成三元复合物。由此，VAV1 SH3-2 RT loop中的RDxS序列（796–799）被确立为一个功能性的非经典降解决定簇，与此前IMiDs新底物普遍采用的G-loop范式不同。作者手里也因此多了一张可以在上面做设计决策的界面地图。

从模型到分子：构象限制带来的活性提升

地图给出的第一条设计建议来自化合物本身的柔性。模型显示，NGT-201-12需要采取特定扭转角才能把吲哚环伸向R796，而连接两个环的单键可以自由旋转，这会推高三元复合物形成的熵代价。据此，作者在邻近戊二酰亚胺的苯环上引入小取代基以阻转限制构象，依次考察甲基、氟和氯。

氯代衍生物效果最好：NGT-201-17（苯基）和NGT-201-18（吲哚）相对各自的母体化合物，降解活性尤其是最大降解程度显著提升，内源VAV1的免疫印迹也予以确认。而NanoBRET靶点结合实验显示它们对CRBN的亲和力并没有提高，说明增益来自三元复合物更容易形成。密度泛函理论（DFT）计算随后证实，氯代化合物的关键二面角势能井最深、旋转能垒最高，分子被有效“预组织”在活性构象上。

围绕这一骨架展开的系统构效关系研究进一步印证了模型：苯环邻位取代几乎一律有害，与模型中该位置被CRBN侧链紧紧夹持的预测一致；对位则普遍宽容；替换吲哚环的实验显示富电子芳环明显优于缺电子杂环，符合阳离子-π相互作用的预期。在功能层面，优化后的NGT-201-18在人原代T细胞中引起剂量依赖的内源VAV1降解，并在anti-CD3/CD28刺激下显著抑制活化标志物CD69的上调。

把预测放到合成之前：自由能计算补上最后一环

闭环还缺一块：能否在合成之前就判断哪个类似物更好。作者系统比较了多种打分方法对实验降解活性的预测能力，结果比较明确：基于自由能扰动（FEP）的计算与实验降解活性显著相关，常规对接打分的相关性则很弱。FEP计算出的界面协同性（cooperativity）同样与最大降解程度相关，与“界面能量越有利、降解效率越高”的预期一致。这使得结构模型可以在合成之前对类似物做出定量排序。

闭环的检验与边界

这套“先建模、再设计”的路线可信吗？一项平行的独立工作提供了印证。Petzold等人去年在Science报道了CRBN与VAV1复合物的晶体结构（PDB: 9NFR），同样指向SH3-2的RT loop作为识别元件，与本研究的预测模型高度吻合。而Boltz-2模型的发布早于9NFR在PDB中的公开，排除了模型“记忆”晶体结构的可能。

闭环也标出了自己的边界。作者对多个高活性化合物开展剂量-响应全局蛋白质组学，在确认VAV1是低纳摩尔级主要靶点的同时，发现了一个意料之外的脱靶LIMD1。结构分析显示LIMD1带有一个典型的G-loop降解决定簇，建模与定点突变都证实它通过这一经典基序被招募。同一个分子胶分子可以识别并降解携带两类不同降解决定簇的新底物，这说明结构模型能够前瞻性地指导活性优化，但选择性谱系无法仅凭已知规则推演，仍需依靠系统、无偏的全局蛋白质组学。

综上，本研究提供一条可复用的分子胶研究路径：无偏蛋白质组学发现新底物 → 物理与AI结合预测三元复合物界面 → 定点突变确立降解决定簇 → 以界面模型指导构象限制与构效关系优化 → 自由能计算前瞻排序 → 剂量-响应蛋白质组学评价选择性。它表明在实验结构尚不可得的早期阶段，计算模型配合严格的实验验证足以指导药物化学，从而把分子胶发现从高度依赖筛选与经验，推向一个可迭代、可解释、可预测的闭环。后续工作将聚焦于进一步提升VAV1降解剂的选择性与体内药效，并探索利用类似RT-loop降解决定簇靶向其他蛋白的可能性。

贝勒医学院生化与分子药理系王津（Jin Wang）教授与林瀚丰（Hanfeng Lin）博士为本文的共同通讯作者，林瀚丰、俞鑫、郑海洋为共同第一作者。Thermo Fisher Scientific、YDS Pharmatech、SandboxAQ与Receptor.AI等单位在质谱平台与计算方法方面为这项研究提供了重要支持。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-026-77657-z

制版人： 十一

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