Adv Sci | 王旻晋/严琳团队单细胞多组学揭示抗NMDAR脑炎CX3CR1+ T细胞的克隆扩增与NR1肽响应

抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎（anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis，NMDAR-E）是最常见的自身免疫性脑炎之一，临床可表现为精神行为异常、癫痫、运动障碍、自主神经功能紊乱及意识障碍等。长期以来，其发病机制主要围绕B细胞及抗GluN1自身抗体展开，自身抗体介导的NMDAR内化和突触功能异常被认为是疾病核心病理过程。然而，约40%的患者对一线免疫治疗反应有限或无反应，约25%的患者可出现复发，部分重症患者还伴随显著的中枢神经炎症。这提示除B细胞和自身抗体外，其他免疫细胞尤其是T细胞可能同样参与疾病持续和炎症放大，但其关键细胞群及作用方式仍未完全明确。

近日，四川大学华西医院王旻晋教授/严琳副教授团队在AdvancedScience发表题为Single-Cell Profiling Reveals Clonally Expanded CX3CR1+T Cells inAnti-NMDA ReceptorEncephalitis的研究论文。研究整合单细胞RNA测序、单细胞T细胞受体（TCR）测序和CITE-seq，对NMDAR-E患者外周血及脑脊液免疫状态进行系统解析，并通过独立队列的多参数流式细胞术和NR1肽体外刺激进行验证。研究发现，CX3CR1+ CD4+和CD8+ T细胞是NMDAR-E中较为突出的疾病相关T细胞群体，具有明显的克隆扩增、炎症效应、与B细胞通讯增强及脑脊液富集等特征，其优势TCR克隆还表现出对GluN1来源候选表位较高的预测结合分数。

研究首先从整体免疫图谱出发，对未经治疗的NMDAR-E患者和健康对照进行单细胞多组学分析。结果显示，患者外周血中B细胞和单核细胞比例相对升高，NK细胞减少，其中B细胞呈现更活跃的转录状态，并伴随MHC-II、BCR信号及抗原加工呈递相关程序增强。进一步解析T细胞亚群后发现，患者CD4+和CD8+ T细胞整体表现出更明显的炎症激活和效应分化，其中CX3CR1+ T细胞的疾病相关变化最为突出，富集TNF/NF-κB、细胞毒性、趋化迁移和神经炎症相关通路。CITE-seq在蛋白水平进一步支持了CX3CR1表达变化，提示这类细胞主要处于活跃的炎症效应状态，而非终末耗竭状态。

在明确CX3CR1+ T细胞的异常表型后，作者进一步分析其与B细胞之间的潜在联系。CellChat结果显示，NMDAR-E患者CX3CR1+ CD4+/CD8+ T细胞与多类B细胞之间的通讯增强，主要涉及MHC-II–CD4、MHC-I–CD8、CD99–CD99以及MIF–(CD74+CD44)等信号轴。结合患者外周B细胞抗原呈递相关程序增强的结果，这些发现提示B细胞可能不只是自身抗体的来源，也可能通过抗原呈递及细胞间信号参与T细胞激活；而活化的CX3CR1+ T细胞则可能进一步促进炎症反应，从而形成潜在的T-B细胞协同免疫网络。

TCR克隆分析进一步揭示了CX3CR1+ T细胞的重要特征。患者CX3CR1+ CD4+和CD8+ T细胞均存在明显的克隆扩增，且扩增细胞伴随更强的Ⅰ型干扰素、细胞毒效应、抗原受体信号以及黏附迁移相关程序。作者随后将优势TCR CDR3序列与GluN1来源候选表位进行计算预测，发现19个候选表位具有较高预测结合分数，其中18个覆盖已知抗体结合相关的N368/G369区域；CX3CR1+ T细胞对NR1来源表位的平均预测结合分数也高于CX3CR1⁻ T细胞，并在独立验证队列中重复出现。该结果提示CX3CR1+ T细胞可能经历与NMDAR相关抗原有关的克隆选择，但其真正的抗原特异性仍需进一步直接实验验证。

为了判断这类细胞是否进一步参与中枢免疫反应，作者在独立外周血和脑脊液单细胞队列中进行验证。结果显示，NMDAR-E患者脑脊液中的CX3CR1+ T细胞明显增加，并与高度扩增的TCR克隆共定位，同时呈现T细胞活化、增殖、抗原受体信号、白细胞黏附和趋化等相关程序增强。多参数流式细胞术进一步证实，患者脑脊液中总CX3CR1+ T细胞以及CX3CR1+ CD4+、CX3CR1+ CD8+ T细胞比例均升高；配对分析还显示CX3CR1+ CD4+ T细胞在脑脊液中较同一患者外周血进一步富集，支持活化CX3CR1+ T细胞可能被募集或滞留于中枢神经系统。

文章最后，作者使用GluN1356-385肽对外周血单个核细胞进行体外刺激，以进一步评价CX3CR1+ T细胞的功能应答。背景扣除后，NMDAR-E患者在多个肽浓度条件下均表现出更高比例的CD154+和CD137+应答细胞；细胞内细胞因子检测进一步显示，患者总CX3CR1+ T细胞以及CD4+CX3CR1+、CD8+CX3CR1+亚群在刺激后产生更多IFN-γ和TNF-α。综上，该研究通过单细胞多组学、TCR克隆分析、细胞通讯、脑脊液验证及NR1肽刺激实验，系统刻画了NMDAR-E中CX3CR1+ T细胞的疾病相关特征，将疾病免疫病理认识从传统的B细胞—自身抗体框架进一步拓展至T-B细胞协同及中枢炎症效应，为后续抗原特异性验证和选择性免疫调控研究提供了新的方向。

原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.77608

制版人：十一

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