香港科技大学《自然·通讯》：用AI设计“蛋白质水凝胶”!

蛋白质水凝胶因良好的应力松弛行为，被广泛用作三维干细胞和类器官培养的人工细胞外基质。其黏弹性深刻影响细胞感知、黏附、增殖与分化，应力松弛速率已成为组织工程的关键设计参数。将链间缠结蛋白质结构域引入水凝胶网络，可提供非共价交联，增强链迁移性并加速力耗散。然而，现有缠结基序仅限于p53二聚化结构域、HP0242及其突变体等少数天然蛋白，结构多样性与黏弹性可调性严重受限。从头设计缠结拓扑极为困难，因为空间缠结界面在蛋白质折叠中动力学不利，当前方法多依赖天然重复单元串联复制，难以系统改变缠结二聚体的序列与结构特征，更遑论将其作为物理交联用于黏弹性网络。

针对这一挑战，香港科技大学高寒宇助理教授、孙飞教授合作，提出了TangleDiff——一个用于从头设计具有可编程特征的同源二聚体缠结蛋白的深度学习框架。研究者首先挖掘序列数据库识别有利于链缠结的特征，进而开发基于潜在扩散的生成模型TangleDiff，可生成多样、可折叠且满足用户指定性质约束的缠结序列。候选序列经计算筛选后进入实验验证。TangleDiff生成的缠结序列在计算机模拟中的成功率超过70%，显著优于现有模型（约1%）。以链间结合能为条件，模型生成的新型二聚体其结合能与指定范围高度吻合，成功设计中约70%符合预期值。实验上，研究者设计了九个靶向不同结合能的同源二聚体，其中七个成功形成水凝胶，应力松弛动力学与指定结合能相关。该工作建立了缠结蛋白设计的通用策略，为基于缠结的生物材料创新开辟了道路。相关论文以“Generating protein hydrogels with customizable stress relaxation behavior via deep learning-driven entanglement design”为题，发表在Nature Communications上。

数据集构建与模型设计。研究者从UniRef50出发，采用两阶段筛选策略，处理数千万条序列，最终整理出包含79,890条缠结序列、归为32,339个簇的大型数据集，这些缠结同源二聚体主要属于细菌域（图1）。缠结判定采用绝对高斯链接数（GLN）≥0.7，并要求C2对称性和pLDDT≥80，以保证预测结构可靠。TangleDiff的核心创新在于将扩散过程施加于预训练蛋白质语言模型（PLM）的logit张量上：模型学习从高斯噪声中恢复未加噪的logit张量，经argmax解码生成序列（图2）。研究采用Diffusion Transformer架构，通过adaLN-Zero模块实现条件生成，并引入自条件策略提升生成性能。训练过程中MAE持续下降，生成性能稳步改善。

图1 | 数据集构建。a 从UniRef50出发的两阶段数据收集流程。b 用于识别高质量、高可靠性缠结同源二聚体结构的计算序列过滤工作流。c UniRef50中12,742,356条长度50至100的代表序列的序列筛选命中率。d 第二阶段79,453条长度50至100的成员序列的序列筛选命中率。e 79,890条发现的缠结序列中有50,727条被成功归入三个结构域组。

图2 | TangleDiff模型设计与开发。a 潜在扩散训练。扩散应用于建模预训练蛋白质语言模型的归一化logit分布，通过学习恢复加噪潜在表示。b TangleDiff推理。随机初始化的高斯噪声向量Z_T经历T步预测和去噪过程，之后被反归一化并解码为所需序列。c DiT块架构。在每个扩散步骤，含噪潜在Z_t和上一步预测的未加噪潜在Z_o被拼接并输入Diffusion Transformer（DiT）架构，该架构使用adaLN-Zero DiT块整合条件信息并预测去噪潜在Z_{o,t-1}。d 重建损失（MSE）随训练进展下降。e 在不同训练步骤采样的40条序列上评估的指标表明成功学习了缠结蛋白序列的特征。相似性指与训练序列相比的最近序列一致性。DiT：Diffusion Transformer；adaLN-Zero：零初始化自适应层归一化；MSE：均方误差；BE：结合能。源数据见源数据文件。

无条件生成性能。为评估无条件生成能力，研究者设计了4000条序列，用ESMFold和AlphaFold2分别预测结构。结果显示，TangleDiff能产生平均pLDDT约80、缠结百分比超过80%的可靠缠结同源二聚体，总体计算机设计成功率超过70%，大幅超越现有序列生成模型（最佳替代方案仅1.02%）（图3）。多数设计序列与训练序列的最近序列一致性在0.4至0.6之间，部分设计进化距离遥远（一致性<30%），凸显其泛化能力。UMAP分析表明，4000个设计有效覆盖了约80,000条训练序列定义的序列空间。生成的设计跨越α主导和β主导拓扑，既可设计功能性缠结同源二聚体（如DNA/RNA结合蛋白），也能生成PDB中无相似对应物的全新结构。消融研究证实，预测初始潜在而非噪声、自条件、线性噪声调度及ESM2 logits归一化均对性能有显著贡献。

图3 | TangleDiff无条件生成新颖多样的蛋白质序列，具有高可折叠性和高缠结率。a ESMFold报告的4000条设计序列的pLDDT分布和缠结百分比。b AlphaFold2报告的4000条设计序列的pLDDT分布和缠结百分比。c 成功率与pLDDT阈值的关系。成功率定义为既缠结又具有高于指定pLDDT的预测结构的比例，基于4000个生成设计计算。d 不同pLDDT范围内设计序列与训练集的最近序列一致性分布。最近序列一致性由Blastp搜索训练序列报告。最近序列一致性小于0.3（进化上遥远）的设计百分比已标注。e 天然和设计缠结同源二聚体的蛋白质水平ESM2-650M序列嵌入的Uniform Manifold Approximation and Projection（UMAP）。UMAP在79,890条训练序列上拟合。设计序列按与训练序列相比的最高序列一致性着色。天然缠结序列以灰色表示，颜色越深表示密度越高。f TangleDiff设计功能性缠结同源二聚体，与已知实例相比序列一致性低。序列一致性和TM-score由Foldseek根据比对部分报告。g TangleDiff设计新颖缠结同源二聚体，与已知结构数据库中任何结构均不相似。最近序列一致性由Blastp搜索训练序列报告。h 用于将离散蛋白质序列映射为连续嵌入的不同编码器比较。指标在每种编码器的4000条无条件生成序列上计算。i 消融研究。TangleDiff使用ESM2-650M作为序列编码器，训练以线性噪声调度、归一化和自条件技术预测去噪潜在。指标在每种设置的4000条无条件生成序列上计算。源数据见源数据文件。

条件生成与虚拟筛选。TangleDiff可通过adaLN-Zero模块在任何蛋白质水平标签上条件化。研究者以链间结合能为条件，训练模型生成具有特定结合能的缠结蛋白。对于所有五个条件范围，大多数生成蛋白的结合能落在指定区间内，且结合能范围可超出从UniRef挖掘的天然序列（图4）。研究者进一步以三个特定结合能组（C0：<-160 REU；C2：-140至-120 REU；C4：>-100 REU）各生成4000条序列，经虚拟筛选（序列-结构对应性、缠结与稳定折叠、可溶表达）后，每组随机选取三个设计用于实验验证。有趣的是，强结合能设计主要由β折叠形成缠结，中等和弱结合能设计则显示与RHH超家族相关的缠结，较弱者缠结结构更浅；且强结合能设计在训练集中缺乏相似序列，新颖性最高。

图4 | 不同链间结合能的缠结同源二聚体设计与虚拟筛选。a 通过条件化TangleDiff生成结合能以控制缠结交联水凝胶流变行为的示意图。b 设计的缠结同源二聚体的链间结合能与生成时指定的结合能范围高度吻合。每种条件生成400条序列。数字表示每个区间代表的设计数量。中心线表示中位数，箱边界表示第25和第75百分位数，须线表示1.5倍四分位距内的最小值和最大值。须线外的异常值未显示。c Rosetta结合能与Rosetta单位结合表面积结合能之间的相关性。BE Condition指生成时指定的条件。100BE/BSA指100倍Rosetta结合能除以埋藏表面积。每种条件生成400条序列。d Rosetta与gmx_MMPBSA计算的结合能之间的相关性。不同颜色表示不同Rosetta结合能范围。c、d中实黑线表示线性拟合，阴影带表示使用1000次bootstrap重采样估计的95%置信区间。e 每种结合能条件下4000条生成序列的虚拟筛选流程。BE指Rosetta结合能。黑色数字指初始生成或每步筛选后保留的序列数量。不同结合能条件生成的序列用不同颜色标记。f 选择用于实验验证和水凝胶制备的九个设计缠结同源二聚体的AlphaFold2预测结构。g 九个选定设计与训练序列的最近序列一致性。源数据见源数据文件。

实验验证与水凝胶制备。研究者开发了A-X-A、B-X-B和B-B-B三种基因构建体，利用SpyTag/SpyCatcher系统合成两类蛋白质网络：A-X-A + B-X-B（线性共价链，凝胶性质源于物理缠结）和A-X-A + B-B-B（共价交联支化网络，交联点与物理缠结共同贡献）（图5）。所有融合蛋白均在大肠杆菌中以可溶形式成功表达，CD光谱显示α-β混合模式，SEC-MALS确认九个设计中有八个形成二聚体。八个设计中有七个成功制成两类凝胶。流变学测试表明，由弱结合能设计（C4、C2）制成的A-X-A + B-X-B水凝胶表现出显著应力松弛行为，而强结合能设计（C0）则呈弹性特性、无显著松弛（图6）。连续弛豫谱显示C4_370和C2_1020分别在ω约0.3 rad/s（τ约2.4 s）和0.06 rad/s（τ约12.8 s）处出现耗散峰，C4_370峰频率更低，证实其结合能更弱。A-X-A + B-B-B网络在相同位置出现弛豫峰但峰高更高，表明共价交联增强弛豫强度而不改变弛豫时间。阴性对照C4_1771（未形成二聚体）仅产生黏稠液体，无应力松弛行为，证明水凝胶的松弛行为源于物理缠结而非共价交联点或ELP链动力学。

图5 | 缠结交联蛋白质水凝胶的实验验证与制备。a A-X-A、B-X-B和B-B-B构建体，以及通过SpyTag/SpyCatcher共价异肽键连接形成的网络。A-X-A + B-X-B形成线性共价链，其凝胶性质源于设计X结构域的物理缠结。A-X-A + B-B-B形成共价交联的支化网络，其中共价交联点和物理缠结均对机械性能有贡献。b 九个A-X-A设计的SDS-PAGE。c 对九个A-X-A设计以及作为对照的A-A-A和p53dim进行CD光谱分析。测量独立重复三次，结果相似。d 九个A-X-A设计的SEC-MALS结果。测量独立重复三次，结果相似。e 制备的A-X-A + B-X-B型蛋白质水凝胶。f 制备的A-X-A + B-B-B型蛋白质水凝胶。源数据见源数据文件。

图6 | 14种制备的蛋白质水凝胶网络的流变学测试。a 动态力学分析和连续弛豫谱示意图。b A-X-A + B-X-B网络的动态力学分析和计算的连续弛豫谱。c A-X-A + B-B-B网络的动态力学分析和计算的连续弛豫谱。

总结与展望。与以往通过重复单元串联复制设计结和缠结二聚体的工作相比，本研究的数据驱动流程所需专业知识极少，跨越更大的结构和序列设计空间，并能根据用户定义的分子性质进行控制。TangleDiff隐式学习缠结特征，直接生成完整缠结结构域，无需领域专业知识和精确几何控制。所设计的缠结二聚体展现出显著的序列和结构多样性，结合能与指定范围高度吻合。该条件化框架可扩展到缠结程度、动力学稳定性、二级结构组成等其他分子水平性质，并可无缝集成性质判别器。由于TangleDiff是序列生成模型，通过适当数据训练可扩展到具有C3对称性的同源三聚体甚至更高阶结构。研究者相信，具有更高阶对称性的缠结蛋白将显著增强缠结交联蛋白质网络的复杂性和多样性，是未来工作的重要方向。本研究整合数据挖掘、机器学习、虚拟筛选和实验，为控制宏观凝胶性质提供了端到端策略，为3D干细胞和类器官培养中的ECM设计开辟了道路。