南京中医药大学1区top: 复方丹参滴丸通过增强血管完整性和改善炎症反应延缓脑海绵状畸形的进展

【写在前面】：本期推荐的是由南京中医药大学药学院-江苏省中药药理与安全性评价研究重点实验室\南京中医药大学医学院生物化学与分子生物学系等研究团队合作近期发表于Phytomedicine(IF11.3）的一篇文章，揭示复方丹参滴丸通过增强血管完整性和改善炎症反应延缓脑海绵状畸形的进展。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Compound Danshen Dripping Pills retards the progression of cerebral cavernous malformations via strengthening vascular integrity and ameliorating inflammatory response

背景

脑海绵状畸形（CCMs）的特征是大脑中异常聚集的扩张薄壁毛细血管，这些毛细血管容易出血，导致一系列神经系统症状，包括癫痫发作和中风。目前的治疗策略仅限于手术切除，强调了对有效和高效治疗的要求。

目标

在这项研究中，我们研究了复方丹参滴丸（CDDP）作为一种中药（TCM）对CCMs进展的治疗潜力。

方法

采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）对CDDP的化学成分进行表征，并鉴定其脑穿透成分。通过宏观观察、微型计算机断层扫描（microCT）和组织学分析评估损伤负荷。通过免疫荧光染色评估血管完整性和功能。通过激光散斑对比成像评估血流，并使用伊文思蓝染料和FITC葡聚糖检查渗透性。采用多种组学方法，包括RNA测序（RNA-seq）、蛋白质组学和代谢组学，来破译分子机制。采用Western blot和定量实时PCR（qPCR）检测关键信号通路。通过UPLC-MS/MS鉴定脑穿透成分，然后对靶蛋白（MEKK3和NF-κB）进行分子对接和分子动力学模拟。进行表面等离子体共振（SPR）测定，以验证所鉴定的关键成分与其各自靶蛋白的直接结合亲和力。通过检测下游介质的磷酸化水平，在过表达MEKK3的HEK293T细胞（HEK293T/MEKK3-OE）中评估靶结合的功能影响。用鉴定的成分（人参皂苷F3和丹参酮I）处理脂多糖（LPS）刺激的KRIT1敲除的人脑微血管内皮细胞（HCMEC/D3），并评估其跨内皮电阻（TEER）和关键炎性细胞因子的表达。

结果

UPLC-MS/MS鉴定出CDDP中的36种成分，包括酚酸、生物碱和人参皂苷。CDDP治疗剂量依赖性地降低了Krit1iECKO小鼠的CCM损伤负担，0.2 g/kg的剂量显示出与普萘洛尔相当的最佳疗效。免疫荧光显示，CDDP通过上调Claudin-5和VE钙粘蛋白表达、增加周细胞覆盖率和使基底膜支持正常化，显著增强了血管完整性。功能测定表明，CDDP恢复了脑血流，降低了血管通透性。综合转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析表明，CDDP显著下调了MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4-p-MLC2信号轴，并抑制了涉及NF-κB、ICAM1、VCAM-1、IL-6、IL-1β和中性粒细胞胞外陷阱（CitH3）的炎症网络。顺铂有效地逆转了地普罗维辛诱导的CCM病变加重，证实了MAPK和NF-κB通路的参与。脑组织分析确定了11种脑穿透成分，包括丹酚酸和人参皂苷。分子对接和分子动力学模拟表明，人参皂苷F3与NF-κB表现出最佳的结合亲和力，而丹参酮I与MEKK3强烈结合。SPR分析进一步证实了直接结合，人参皂苷F3与NF-κB结合，丹参酮I与MEKK3结合。HEK293T/MEKK3-OE细胞的功能验证表明，丹参酮I显著抑制了MEKK3驱动的MEK5和ERK5磷酸化，而人参皂苷F3显著减弱了NF-κB磷酸化。在Krit1iECKO小鼠中施用人参皂苷F3、丹参酮I或其组合可减少小脑出血性病变和血管渗漏，联合组显示出最显著的治疗效果。在KRIT1敲除HCMEC/D3细胞中的体外验证表明，人参皂苷F3、丹参酮I及其组合显著恢复了TEER值，降低了IL-1β和IL-6的表达，且该组合显示出协同作用。

结论

CDDP通过增强血管完整性、恢复内皮屏障功能以及通过抑制MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4-p-MLC2和NF-κB信号通路抑制炎症，对CCM进展具有治疗作用。脑穿透成分，特别是人参皂苷F3和丹参酮I，直接靶向关键蛋白（NF-κB和MEKK3），协同保护内皮功能。这些发现提供了临床前证据，支持CDDP作为CCMs的一种有前景的多靶点治疗策略。

图文摘要

【前言】

脑海绵状畸形（CCMs）是中枢神经系统常见的血管发育不良，估计影响世界人口的0.3%至0.5%，多达三分之一的人在一生中出现癫痫发作、出血或局灶性缺陷等症状。病变自然史被认为是异质的：既往出血、脑干位置和病变多样性是再出血和残疾的最强预测因素，突显了监测或手术之外有效和高效治疗的重要性。CCMs可能有散发性（80%）和家族性（20%）两种形式，家族性CCMs容易由KRIT1/CCM1、CCM2或PDCD10/CCM3中的种系功能丧失变异引起，伴有体细胞第二次撞击产生内皮镶嵌和病变形成，在散发病例中也有野生型等位基因的体细胞失活的报道，验证了整个谱系中的“两次撞击”范式。中药方剂提供了多组分和多靶点的干预方法，与CCMs的系统级病理生物学相一致。

复方丹参滴丸（CDDP）是一种基于中医理论的现代药物制剂，在许多国家已被广泛用于预防和治疗缺血性心脏病。此外，CDDP还经历了2016年美国食品药品监督管理局批准的随机、双盲和国际多中心III期临床试验。作为CDDP的核心成分，丹参和三七类成分具有显著的内皮保护和抗炎作用。例如，包括丹酚酸B在内的酚酸能够穿透血脑屏障并抑制MAPK/NF-κB信号通路，从而维持紧密连接（TJ）并降低血管通透性；亲脂性丹参酮（如丹参酮IIA、隐丹参酮）易于通过抑制NF-κB和下调ICAM1/VCAM1的表达来限制内皮细胞的活化；三七皂苷倾向于缓解内皮功能障碍和减轻炎症粘附。这些药理学特性精确地涉及CCMs中涉及的关键节点——MAPK/KLF2/KLF4信号传导、NF-κB/IL-6炎症网络、粘附分子和BBB完整性——表明含有脑可及成分的CDDP可能会重新平衡内皮稳态，改善CCMs神经血管单位（NVU）内的炎症反应。

在本研究中，我们发现CDDP在阻碍CCMs进展方面发挥了显著作用。借助超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS），我们确定了CDDP的化学成分，并鉴定了其脑可及成分。在经验证的CCMs小鼠模型中，我们证明CDDP能够改善血管结构和功能。更具体地说，免疫荧光和功能检测表明，CDDP重塑了血管结构，保留了屏障功能，并调节了EC和星形胶质细胞之间的相互作用。综合转录组学、蛋白质组学和代谢组学揭示，CDDP至少部分通过调节MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/KLF4-p-MLC2信号通路和炎症网络（包括IL-6、ICAM-1、VCAM-1、CitH3和NF-κB）来抑制CCM的发展。蛋白质印迹分析和基于激动剂的验证实验支持了因果信号通路的参与，将大脑暴露的成分与通路调节和表型拯救联系起来。此外，我们进行了分子对接和分子动力学模拟，以鉴定关键的脑穿透成分（人参皂苷F3和丹参酮I）及其与靶蛋白（NF-κB和MEKK3）的直接相互作用。通过表面等离子体共振（SPR）分析实验验证了这些成分与其各自靶标的直接结合。靶点结合的功能后果在HEK293T/MEKK3-OE细胞中得到了进一步证实，其中丹参酮I抑制了MEKK3驱动的MEK5/ERK5磷酸化，人参皂苷F3减弱了NF-κB磷酸化。与单一疗法相比，人参皂苷F3和丹参酮I的组合在Krit1iECKO小鼠中显示出更优的协同疗效。KRIT1敲除人脑微血管内皮细胞（HCMEC/D3）的体外验证表明，这些生物活性化合物协同恢复内皮屏障功能并抑制炎症反应。综上所述，我们的研究结果表明，CDDP可能是CCMs患者的一种有前景的治疗策略。

【结果部分】

1.采用UPLC-MS/MS技术对CDDP的化学成分进行分析。

2.CDDP以剂量依赖的方式减轻Krit1iECKO小鼠的CCM损伤负担。

3.CDDP修复CCM病变中的异常血管并增强血管功能。

4.综合蛋白质组学和转录组学分析揭示了顺铂治疗Krit1iECKO小鼠的分子机制。

5.CDDP通过抑制内皮细胞MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4-p-MLC2信号轴来保护血管内皮。

6.CDDP通过抑制NF-κB/VCAM-1/ICAM1和NF-κB/IL-6/IL-1β信号通路减轻内皮炎症。

7.CDDP逆转了MAPK和NF-κB激动剂Diprovocim引发的CCM的恶化进展。

8.筛选CDDP的脑穿透成分并验证其与关键靶点的相互作用。

9.人参皂苷F3与丹参酮I通过靶向调控 NF -κB及MEKK3信号通路，协同抑制CCMs的发生发展。

10.CDDP阻止CCM发展的潜在机制示意图。

【结论与讨论】

总之，我们的研究结果表明，CDDP具有通过多种互补机制预防CCM进展的治疗潜力，包括增强血管完整性、减轻神经炎症和恢复内皮功能。通过靶向MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4信号轴和NF-κB炎症网络——由Krit1缺失驱动的两个协同致病级联——CDDP提供了一种全面、多靶点的方法来管理这种具有挑战性的疾病。重要的是，我们阐明了CDDP的药效物质基础，证明脑穿透成分人参皂苷F3和丹参酮I分别直接与NF-κB和MEKK3结合，并在体外和体内协同保护内皮屏障功能。CDDP完善的临床安全性和口服生物利用度进一步促进了其转化潜力，使其成为临床治疗CCM患者的有前景的候选药物。

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