NSMB丨“坚如磐石亦可摧”：季哲剑团队破解Cdc48/p97复合体解折叠泛素蛋白的分子机制

泛素 - 蛋白酶体系统是真核细胞 靶向 降解蛋白质的核心通路。 通常情况下 ， 待降解 的 底物 蛋白 先 被 K48 连接的多聚泛素链标记 ，随后 被 招募至 蛋白酶体。 蛋白酶体通过识别底物蛋白上的无序肽段 ，逐步将其降解【1】。然而，对于缺乏无序肽段的底物蛋白，则需先由Cdc48/p97 ATP酶进行“预处理”，将其解折叠成线性多肽之后，方能被蛋白酶体识别并降解【2】。

此前研究表明，Cdc48/p97复合体无需ATP供能，仅 凭 分子间相互作用即可将泛素分子解折叠。这一将泛素转化为线性多肽的过程，是Cdc48/p97复合体识别与处理底物蛋白的关键起始步骤【3】。然而，泛素分子以其超高的热力学稳定性和极强的复折叠能力著称。Cdc48/p97复合体究竟如何诱导泛素解折叠？其背后的分子机制长期悬而未决。

2026 年 9 月 10 日， 西湖大学生命科学学院季哲剑课题组在Nature Structural & Molecular Biology在线发表了题为 ATP-independent unfolding of ubiquitin by Ufd1 initiates Cdc48/p97-mediated substrate processing 的研究论 文 。该工作首次揭示，位于辅助因子Ufd1蛋白上的UT3结构域是诱导泛素解折叠的“执行者”。UT3能够同时结合K48连接的两个相邻泛素分子，迫使其中一个泛素分子发生构象扭曲，从而促进其解折叠。这一发现不仅深化了对辅因子Ufd1功能的理解，也拓展了学界对泛素结合蛋白作用范式的认知。

荧光报告系统证实UT3可以解折叠泛素

为 了 直接监测 泛素分子的折叠状态 ，作者构建了泛素突变体Ub I3C （第3位异亮氨酸 突变为半胱氨酸 ）。在 泛素 处于稳定 折叠态 时 ，半胱氨酸侧链 深埋 于蛋白内部 ，难以与 带有 荧光素的马来酰亚胺反应 ； 而 当 泛素 被解折叠时 ，暴露 的半胱氨酸则会迅速与马来酰亚胺形成共价连接。 利用这一 荧光报告系统 ，作者发现双泛素分子与UT3结构域共孵育可诱导泛素解折叠，且该过程完全不依赖ATP。

双位点结合模型揭示解折叠机制

深入研究发现，UT3仅作用于两个及以上、K48连接的泛素链，无法解折叠单个泛素分子。借助AlphaFold3结构预测，作者发现UT3拥有两个泛素结合位点——分别命名为“ ridge ”（脊）和“ cleft ”（槽）（图1）。通过一系列生化与结构生物学实验证实，这两个位点分别结合完整的泛素分子和泛素的C端短肽。若将完整泛素与泛素C端短肽以K48异肽键连接，其与UT3的亲和力将显著提高。

图 1 ：UT3与双泛素分子的复合物结构预测。

通过结构比对，作者观察到结合在UT3 “cleft”位点的泛素分子发生了显著的构象变化。基于此，作者提出了泛素解折叠的分子模型：UT3与K48连接的双泛素分子相互作用，其中一个完整泛素结合在“ridge”位点，另一个泛素的C端多肽则嵌入“cleft”位点。若泛素以完整折叠态强行结合在“cleft”位点，将与该位点附近的  螺旋结构产生空间位阻冲突；因此，为了适应“cleft”位点的结合，泛素分子被迫发生构象旋转（ 视频1 ），其C端多肽形成的扭曲构象降低了泛素整体的结构稳定性，从而更容易发生解折叠。

视频1 ：UT3结合并解折叠泛素蛋白的分子模型

为了验证该模型 ，作者在“ridge”和“cleft”位点分别引入点突变：L55A突变阻断“ridge”位点的泛素结合，E145K突变则阻断“cleft”位点。双泛素解折叠实验显示，这两种突变均导致UT3丧失解折叠活性。此外，在Cdc48-Ufd1-Npl4复合体中引入这些突变，也大幅削弱了其解折叠泛素化底物蛋白的能力。这些数据有力证实，UT3的泛素解折叠能力严格依赖于其两个泛素结合位点的协同作用，且这对Cdc48复合体对底物蛋白的作用至关重要。

Npl4捕获线性泛素并传递至Cdc48/p97

泛素分子被UT3解折叠后，如何被Cdc48/p97 ATP酶捕获？研究发现，另一个辅因子Npl4在此过程中扮演了关键角色，负责将线性泛素多肽呈递给ATP酶。Npl4与线性泛素的相互作用不仅能稳定解折叠状态的泛素分子，还能有效抑制其复折叠倾向。

图 2 ：Cdc48/p97复合体作用于泛素化底物的 完整工作模 型 。 Npl4 首先结合多聚泛素链中的某个泛素 分子 ， 启动底物招募；随后 UT3 的 “ ridge ” 和 “ cleft ”位点 同时结合两个相邻泛素，诱导 结合在 “ cleft ” 位点的泛素发生 解 折叠。 随后 ，线性化的 泛素被 Npl4 捕获，并 被 精确呈递至 Cdc48 中央孔 道 。接着，线性 泛素的 N 端 多肽 进入 中央 孔道形成 “ 起始复合 体 ” 。整个过程中 UT3 诱导泛素解折叠及 “ 起始复合 体 ” 组装均不依赖 ATP 。 最后 ，Cdc48/p97酶在ATP水解的驱动下进行多肽转运，直至将底物蛋白完全解折叠成线性多肽。

解答领域内长期存在的谜题

本研究合理解释了Cdc48/p97复合体研究中长期存在的两个关键问题：

1.为何复合体特异性识别K48连接的多聚泛素？UT3的两个泛素结合位点与泛素的互作模式，决定了其只能与K48连接的泛素匹配。其他连接类型的多聚泛素无法同时满足两个位点的结合要求，因而不能被UT3解折叠，也无法被ATP酶复合体识别。

2.为何多聚泛素链末端的第一个泛素分子不能被ATP酶识别？因为只有结合在“cleft”位点的泛素才会被解折叠，而这要求其之前必须有一个完整折叠的泛素分子占据“ridge”位点以维持稳定结合。若多聚泛素链的第一个分子试图结合在“cleft”位点，由于“ridge”位点空缺，不能形成稳定的双位点结合，故无法触发解折叠。

本研究首次揭示泛素结合蛋白可通过分子间相互作用，在无ATP供能的情况下诱导泛素分子解折叠。这不仅解析了Ufd1辅因子的核心功能，更拓展了泛素结合蛋白与泛素互作的全新范式。

西湖大学生命科学学院 博士研究生 汪妍竹 为该论文的第一作者， 季哲剑 研究员 为通讯作者。 西湖大学生命科学学院黄晶课题组 、西湖大学质谱平台以 及 清华大学刘磊课题组 共同 参与了 此 项研究。

文章链接：

https://www.nature.com/articles/s41594-026-01884-7

季哲剑课题组 致力于解析蛋白质机器对大分子复合体组装与解离的调控机制，并探索其功能失衡与疾病的关联。团队以AAA家族ATP酶为核心切入点，综合运用生物化学、结构生物学与细胞生物学等多学科手段，系统揭示这类蛋白质机器识别并重塑大分子复合体的基本原理。主要研究方向包括：

（1）Cdc48/p97复合体在泛素-蛋白酶体通路中的作用机理；

（2）内质网膜蛋白复合体的组装调控与脂质稳态维持；

（3）核糖体生物合成过程中的质量控制；

（4）基于蛋白质机器的新一代靶向蛋白质降解技术开发。

实验室网站： https://jzj.lab.westlake.edu.cn/

课题组常年招收研究博士研究生、博士后及研究系列人员。欢迎志同道合的青年才俊加盟。

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制版人： 十一

参考文献

1 Prakash, S., Tian, L., Ratliff, K. S., Lehotzky, R. E. & Matouschek, A. An unstructured initiation site is required for efficient proteasome-mediated degradation.Nat Struct Mol Biol11 , 830-837 (2004). https://doi.org:10.1038/nsmb814

2 Li, H., Ji, Z., Paulo, J. A., Gygi, S. P. & Rapoport, T. A. Bidirectional substrate shuttling between the 26S proteasome and the Cdc48 ATPase promotes protein degradation.Mol Cell84 , 1290-1303 e1297 (2024). https://doi.org:10.1016/j.molcel.2024.01.029

3 Twomey, E. C. et al. Substrate processing by the Cdc48 ATPase complex is initiated by ubiquitin unfolding.Science365 (2019). https://doi.org:10.1126/science.aax1033

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