类器官再立奇功，首次捕捉“从癌前到癌变”的真实轨迹

文章来源于生信人，作者sunday

肝癌是全球癌症相关死亡的第三大原因，多数患者确诊时已处于中晚期。然而，从癌前病变到极早期肝癌的“临门一脚”究竟如何发生，长期以来仍不清楚，由于缺乏同时包括癌前与癌变组织的配对样本。中国科学院分子细胞科学卓越创新中心惠利健团队联合复旦大学附属中山医院、海军军军医大学东方肝胆外科医院等多家单位，在Cancer Cell发表了一项重磅研究"Molecular insights into early malignant transition of hepatocellular carcinoma"。研究团队从44714例样本中筛选出17例罕见的“结节内结节”的样本，整合全基因组测序、转录组测序、空间转录组及多重免疫组化技术，系统构建了从癌前病变到极早期肝癌的动态演化全景图谱，首次提出两条并行的恶性转化路径。这一研究为肝癌早期预警机制的解析及免疫治疗窗口前移提供了重要理论依据。

一、研究背景

肝细胞癌（HCC）致死率高，关键原因在于癌前阶段向癌变的“关键跃迁事件”长期不清。肝癌并非突然发生，而是经历从慢性肝病、肝硬化、癌前病变到恶性肿瘤的长期演化。异型增生结节（DNs）是最关键的癌前阶段，但仅部分会癌变，多数长期稳定或退化。过去研究多采用彼此独立的癌前与癌样本，只能统计推测，难以真实还原演化轨迹。而“结节内结节”结构因同时包含DNs与极早期肝癌（veHCCs），是研究恶性转化的理想模型，但临床极为罕见。为此，本研究从44714例样本中筛选出17例，再结合WGS测序、RNA测序、空间转录组及多重免疫组化，系统解析肝癌早期演化的关键机制。

二、研究思路

第一步：样本筛选
从44714例FFPE肝脏标本中筛选出17例罕见的“结节内结节”样本，另纳入19例癌前性质未定DNs作为对照。

第二步：多组学解析
对上述样本进行WGS、RNA测序、空间转录组及多重免疫组化检测，系统解析基因组变异、基因表达、细胞空间分布及免疫微环境特征。

第三步：功能验证
利用人诱导肝细胞（hiHep）来源的类器官模型，通过CRISPR敲除/过表达技术验证关键基因（如ECHS1、FGA）在肝细胞过度生长中的驱动作用。

第四步：演化建模
构建系统发育树整合SNV与CNV信息，追踪克隆演化轨迹；整合基因组与免疫特征，提出两条并行的肝癌早期演化路径。

三、主要研究结果

1.DNs向veHCCs的恶性转化

本研究首先从44714例FFPE肝组织中筛选出17极其罕见的“结节内结节”的病例（图1A），在同一病灶内同时存在异型增生结节（DNs）与极早期肝癌（veHCCs），通过H&E染色和GPC3、HSP70、GS免疫组化进一步确认DNs与veHCCs的组织学特征（图1B）。WGS与RNA测序结果分析，DNs与对应的veHCCs共享7%–85% 单核苷酸变异（SNVs），并具有相似突变特征谱（图1C），此外，MRI随访进一步直接观察到DNs向veHCCs的演化过程。随后，研究将17例“癌变倾向型DNs”与19例“癌变潜能未定型DNs”进行比较。结果发现TERT突变在癌变倾向型DNs中检出率达82%，但79%携带TERT突变的DN端粒反而缩短，提示端粒危机持续存在（图1D-1F）。更重要的是，癌变倾向型DNs中拷贝数改变（CNA）负荷显著升高（图1G），尤其涉及EGFR（Chr7p）、MET（Chr7q）、MYC（Chr8q）扩增，提示染色体不稳定性可能是恶性转化关键驱动力。

图1. 样本收集与特征分析

2.驱动DNs向veHCCs恶性转化的关键基因

首先，研究比较了DNs与veHCCs之间的突变负荷差异。结果显示，尽管在更广泛的HCC比较中，veHCCs整体表现出更高的突变负荷，但在成对的癌变倾向型DNs与其对应veHCCs之间，总SNV数量及蛋白编码SNV并无显著差异（图2A），提示SNV积累并不是驱动早期恶性转化的主要变化来源。相比之下，veHCCs的CNA负荷显著升高（图2B），并表现出明显的染色体臂级不稳定性，Chr1q、Chr7p/7q、Chr8q扩增及Chr10q、Chr17p缺失在veHCCs中显著富集，提示广泛的基因组结构重塑（图2C）。进一步研究发现，RB1、TSC1、KRAS等关键肿瘤基因相关CNA仅出现在veHCC中（图2D）。整合分析显示，83%的veHCCs获得额外CNA驱动的CFG改变（图2E-2F）。同时，功能实验进一步验证，ECHS1和FGA在类器官模型中被敲低后均显著促进肝细胞类器官生长（图4G-4K），支持其促癌作用。

图2. DNs恶性转化的关键基因组变异

3.癌前DNs中的“免疫荒漠”微环境特征

为解析早期肝癌演化过程中免疫微环境的动态变化，首先，通过差异表达基因分析、通路富集分析和MCP-counter免疫细胞去卷积，系统比较了癌旁组织、癌前DNs与veHCCs的转录组特征。结果显示，癌变倾向型DNs与癌变未定DNs之间仅有52个差异表达基因，其中癌变倾向型DNs上调基因富集于线粒体ATP合成等代谢通路，而癌变未定DNs中则富集大量snoRNA相关转录本。进一步比较DNs与其对应veHCCs发现，虽然两者存在明确进化关系，但其整体表达谱在PCA空间中明显分离（图3A），提示即使基因组已经发生累积改变，DNs仍未获得典型肿瘤表达程序。最关键的发现是，癌变倾向型DNs中促癌炎症信号通路（TNFα/NF-κB、IL-6/JAK/STAT3、NLRP3炎症小体）显著下调（图3B）。I型干扰素（IFI44L、IFI16）、促炎细胞因子（IL33、IL1B）及Toll样受体（TLR1/2/4）表达均降低，炎症相关纤维化基因（COL4A2、COL6A3）和血管生成基因（FGF2、MMP2）同样下调（图3C）。MCP-counter分析进一步证实，癌变倾向型DNs中成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和T细胞均显著低于癌旁组织（图3D），多重免疫组化确认CD163+巨噬细胞及CD4+/CD8+ T细胞浸润减少（图3E-3H）。并且，这种“免疫低浸润状态”在多数癌变倾向DNs中是稳定存在的。

图3. 癌前DNs中的免疫荒漠表型

4.部分veHCCs中的适应性免疫激活与免疫逃逸并存

首先通过20个核心炎症基因特征评分将veHCCs分为两型：炎症型（43%） 与非炎症型（57%）。炎症型veHCCs表现为T细胞和树突状细胞高度浸润，但CNA负担显著更低（p=0.001）（图4A-4C）。多重免疫组化证实，炎症型veHCCs中CD4+和CD8+ T细胞浸润显著增加（图4D-4F）。尽管免疫细胞被招募，炎症型veHCCs却同时启动明确的免疫逃逸程序, 具体表现为:T细胞耗竭标志物显著上升（图4L）、免疫检查点分子（PD1、PD-L1、CTLA4）上调（图4M））、Treg细胞与免疫抑制相关巨噬细胞富集（图4N）。免疫组化进一步确认PD1+CD8+ T细胞、PD-L1+细胞、FOXP3+CD4+ Treg细胞及CD163+巨噬细胞在炎症型veHCCs中浸润增加（图4P-4S）。此外，炎症型veHCCs还富集了IL6、TNF-α、EMT和KRAS等致癌驱动通路。这些发现表明，约43%的极早期肝癌已建立完整的“免疫激活+免疫逃逸”微环境。

图4. 部分veHCCs中的适应性免疫激活与逃逸

5.空间转录组揭示免疫与基质细胞的组织结构及细胞互作网络

首先，研究对3例炎症型veHCCs及1例非炎症型veHCCs及其配对DNs进行空间解析（图5A），共识别9类主要细胞类型（图5B），包括肿瘤细胞、T细胞、巨噬细胞、B细胞及癌相关成纤维细胞（CAF）。结果显示：炎症型veHCCs中CD4+、CD8+ T细胞、巨噬细胞和B细胞丰度显著增加,而非炎症型则维持低免疫浸润状态（图5C）。进一步空间互作分析显示，CD8+ T细胞与CD4+ T细胞、CAF及巨噬细胞存在广泛的配体-受体相互作用，其中CD4+ T细胞与CD8+ T细胞之间的配体-受体互作最为显著（图5D-5F），而这两类T细胞在空间上高度邻近并形成局部免疫细胞簇（图5G–H），同时这些区域富集T细胞耗竭与Treg相关信号（图5I–L）。值得注意的是，CAF在炎症型veHCC中具有关键调控作用，CD8+ T细胞与CAF在空间上紧密共定位（图5M–N），并伴随myCAF及TGF-β信号显著激活（图5O–R）。此外，巨噬细胞（TAM）同样与CD8+ T细胞存在空间互作（图5D–F），并在炎症型veHCCs中显著富集，进一步增强免疫抑制微环境。同时，这些区域还表现出IL6、TNF-α、EMT及KRAS等通路的活化，与bulk RNA-seq结果一致。

图5. 免疫/基质细胞浸润、细胞间通讯及特征激活的空间转录组学分析

6.DNs向veHCCs恶性转化的空间进化场景与个体化免疫演化模型

在前述“基因组驱动 + 免疫重塑”的基础上，研究进一步从空间结构与个体病例两个层面，统一解析DNs向veHCCs跨越恶性阈值的真实演化模式。基于整合的基因组与免疫图谱，本文提出了两条并行的DNs向veHCCs恶性转化路径（图6A）：路径一（CNA主导型，约57%）：该类veHCC表现为显著升高的CNV负担，常伴随TP53异常，并呈现典型的基因组不稳定驱动模式。其微环境特征为非炎症/免疫荒漠型，免疫细胞浸润低，提示肿瘤在“低免疫监视背景”中完成快速基因组扩张；路径二（炎症/免疫逃逸型，~43%）：该类veHCCs与配对DNs在CNV图谱上高度一致，几乎无显著结构性改变，但却呈现截然不同的微环境状态：表现为炎症信号激活+适应性免疫细胞浸润+同时伴随免疫抑制程序启动（PD1/PD-L1、Treg、TGF-β轴），构成“免疫激活-免疫逃逸并存”的双态结构。系统发育树分析显示，路径一以P6为代表，以TERT异常为起点，在克隆主干基础上逐步累积大量CNV事件（图6B），推动基因组结构快速重塑；路径二以P3为代表，veHCCs与DNs的CNV几乎完全一致，提示恶性转化主要由微环境重编程驱动，而非基因组突变扩增（图6C）。尤为关键的是，P8病例中同一DNs同时演化出两种不同类型的veHCC：P8_veHCC2（CNA主导型，14条染色体CNV）与P8_veHCC1（免疫逃逸型，CNV与DNs基本一致但形成三级淋巴结构，PD1+CD8+ T细胞、Treg细胞、PD-L1+细胞浸润）（图7A-7G）。这完美证明了两条演化路径独立、并行且可共存。

图6. DN恶性转化的演化场景

图7. P8病例的演化场景

四、小编总结

这项研究最大的价值，在于重新定义了肝癌“从癌前到极早期癌变”的真实发生方式。相比传统将肿瘤发生视为突变逐步累积的线性过程，作者通过极其罕见的“结节内结节”的病例，向我们揭示了肝癌并不是单点突变驱动的结果，而是一个在空间中已经发生分叉与竞争的演化系统。

从临床角度看，这项研究至少打开了两扇窗：第一，TERT突变和CNV 负荷可作为DNs风险分层的分子标志物，帮助判断哪些癌前病变需要积极干预；第二，约43%的极早期肝癌已建立完整的免疫抑制微环境，为免疫治疗的“窗口前移”提供了理论依据。

仅用于学术分享，侵删。

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