FSHW | 基于HAuCl4/H2O2反应体系和Pt/Au纳米酶的增强SERS配体传感器对石房蛤毒素的灵敏检测

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Introduction

海洋生物毒素（marine biotoxins，MBs）很容易通过食物链进入人体，如食用水产品（贝类、螃蟹、蛤蜊等）或直接饮用被海洋生物毒素污染的水。MBs引起的中毒严重威胁着人类健康。其根据中毒症状可分为麻痹性贝类中毒（PSP）、健忘性贝类中毒（ASP）、腹泻性贝类中毒（DSP）、神经毒性贝类中毒（NSP）和西加鱼毒（CFP）5类。根据其化学结构，MBs又分为8类：甲藻酸毒素（AZAs）、短毒素（BTXs）、环亚胺（CIs）、软骨藻酸（DA）、冈田酸（OA）、扇贝毒素（PTXs）、石房蛤毒素（STX）和虾夷扇贝毒素（YTXs），其中STX是PSP中毒性最大的海洋生物毒素之一，引起了人们的广泛关注。STX是由海洋鞭毛藻和淡水蓝藻产生的，可引起急性中毒症状，如神经毒性中毒、麻痹、呼吸停止、心血管疾病甚至死亡。

表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）以其灵敏度高、快速、操作方便、指纹识别等优点被广泛应用于食品安全检测中。无标签和基于标签的方法都依赖于SERS衬底的信号增强能力，并且只有贵金属如Au、Ag、Cu等纳米级粗糙材料表面可产生显著的SERS效应。特别是，在两个纳米颗粒之间的紧密连接处才会观察到显著的信号增强现象，这些纳米颗粒位于纳米间隙区域，被称为SERS检测的“热点”。

在水相体系中，适配体传感器被认为是食品安全检测的有力工具。适配体与靶标之间的特异性识别主要依赖于化学相互作用和补体形状匹配。适配体具有特异性和亲和力高、稳定性好、成本低、合成简单等优点，基于此优点，许多适配体传感器被设计并应用于食品污染物的检测中。

本研究设计了一种基于HAuCl4/H2O2反应体系和Pt/Au纳米酶的增强型SERS适配体传感器，用于STX的灵敏检测。首先采用原位还原法制备Fe3O4@Au NPs，SERS信号标签4-MBA通过Au-S键吸附在Fe3O4@Au NPs表面。在Fe3O4@Au NPs上进一步修饰STX适配体（Apt），以制备信号探针Fe3O4@Au NPs-Apt（图1A），Fe3O4与Apt结合可以实现对STX的简单识别并与水相分离。将互补DNA （cDNA）与Pt/Au NZs杂交（图1B），以制备捕获探针Pt/Au-cDNA。然后，通过碱基互补配对，将信号探针和捕获探针混合孵育形成络合物。在STX存在的情况下，它会与cDNA竞争，Pt/Au-cDNA会从复合物中释放出来，产生较少的Au NPs，从而导致低SERS信号输出。然而，在STX不存在的情况下，Pt/Au- cDNA复合物将产生更多具有高SERS强度的Au NPs（图1C）。将基于纳米酶和适配体的免疫分析方法与SERS相结合，具有较高的灵敏度和选择性、良好的稳定性和准确性。在外加磁场作用下，该方法操作简单，洗涤步骤方便。该方法对STX检测具有良好的稳定性，在食品安全控制中具有广阔的应用前景。

图1基于HAuCl4/H2O2反应介导的表面增强拉曼散射适配器传感器检测STX的示意图

Results and Discussion

Fe3O4@Au NPs和信号探针的表征

如图2扫描电镜图像所示，Fe3O4呈球形，平均粒径为195 nm，Fe3O4@Au NPs复合材料表现出颗粒间的粘附，平均尺寸为254 nm，但由于Au NPs的尺寸较小，因此在图像中不清晰可见。如图3所示，Fe3O4没有明显的特征吸收峰，而Au NPs和Apt的特征吸收峰分别位于512和260 nm处，这也表明Fe3O4@Au NPs和Fe3O4@Au NPs@4-MBA-Apt制备成功。此外，Fe3O4、Fe3O4@Au NPs、Fe3O4@Au NPs@4-MBA和Fe3O4@Au NPs@4-MBA-Apt的Zeta电位从﹣7.69 mV上升到﹣31.73 mV，然后下降到﹣50.13 mV，这是由于信号探针Apt中磷酸基团的负性质。

图2Fe3O4和Fe3O4@Au NPs的透射电镜图像

图3Fe3O4@Au NPs和信号探针的紫外可见光谱、水动力直径和Zeta电位表征

Pt/Au NZs和捕获探针的表征

采用稳态动力学方法研究了Pt/Au NZs的催化活性，通过实验结果计算Pt/Au NZs的Km值为0.11 mmol/L，小于辣根过氧化物酶（HRP）的Km值0.434 mmol/L，由此可知Pt/Au NZs具有优越的类酶催化活性。

图4 Pt/Au NZs的稳态动力学分析

如图5所示，Pt/Au NZs多呈分散性球形，尺寸统计约为8.2 nm。其中，透射电镜图像显示，Pt和Au元素均匀分布在纳米结构中，证实了Pt/Au NZs的形成。Pt/Au- cDNA在形貌上也多为分散性球形，能谱表征显示，该材料不仅含有Pt和Au元素，还含有P元素，分析结果显示P元素来源于互补cDNA。

图5 Pt/Au NZs和Pt/Au-cDNA的透射电镜图像及能谱表征

如图6紫外可见分析所示，Au NPs的最大吸收峰为512 nm，Pt/Au- cDNA的最大吸收峰为260 nm，而Pt/Au NZs的吸收峰消失。同时，cDNA、Pt/Au NZs和Pt/Au cDNA的Zeta电位从−26 mV增加到−4.97 mV，表明cDNA在Pt/Au NZs表面修饰成功。以上结果表明Pt/Au-cDNA已成功制备。

图6 Pt/Au NZs和Pt/Au-cDNA的紫外可见光谱、电位等表征

实验参数优化

实验参数的控制是传感器优化过程的关键。如图7所示，优化了两种探针的组合比例和孵育时间。结果显示，最佳组合比例为1:2，最佳孵育时间为60 min。

图7两种探针的组合比例和孵育时间的优化

SERS传感器的分析性能

在最佳检测参数下，通过检测不同浓度（0.02、0.2、0.4、0.6、0.8和2 μmol/L）的STX，评价SERS适配体传感器的分析性能。如图8所示，随着STX浓度的增加，SERS强度成比例地降低，这是由于STX选择性识别并结合到信号探针上导致捕获探针的释放。选择1072 cm−1处的拉曼散射峰强度建立线性关系。线性拟合得到的检测方程为：y＝4619.84－897.72x（R2＝0.9935），在0.02～0.8 μmol/L范围内具有良好的线性关系，检出限（LOD）低至13 nmol/L（信噪比，S/N=3）。因此，该方法实现了STX痕量的定量测定。最后评估了传感器的选择性，重复性、稳定性。

图8不同浓度STX的拉曼光谱和标准曲线

图9选择性、重复性和稳定性

实际样品的检测

为验证SERS适配体传感器在食品样品中的实际应用，选择花蛤、蟹、虾和螺进行加标回收试验。其中，花蛤加标回收率为78.75%～150%（RSD范围为4.67%～5.72%），蟹加标回收率为86.25%～150%（RSD范围为5.94%～6.52%），虾加标回收率为75%～100%（RSD范围为4.80%～6.74%），螺加标回收率为71.25%～100%（RSD范围为4.88%～5.73%）。可以预见，SERS适配传感器在实际食品样品检测中具有普遍适用性和潜力。

Conclusion

综上所述，基于HAuCl4/H2O2反应体系和Pt/Au NZs，构建了一种增强的SERS配体传感器，用于STX的灵敏和选择性检测。SERS传感器表现重复性好，稳定性高，检测精度可接受的特点，在海产品安全检测中具有良好的实用性和广泛的适用性。同时，该方法使用简单，方便、灵敏地检测STX。因此，将该方法推广到食品安全和控制检测领域具有重要意义。

第一作者

李月青，海南大学2022级食品加工与安全专业硕士研究生，主要研究方向为海洋生物毒素的快速检测。

通信作者

吴龙，副教授，博士，硕士/博士生导师，海南大学高层次引进人才，“武汉黄鹤英才”优秀青年人才，海南省食品安全风险评估委员会委员。主要从事热带农产品质量与安全检测和快速检测方法研究。主持国家自然科学基金2项、海南省自然科学项目、国家重点实验室项目、海南大学高层次人才项目、校企服务等各类项目10余项。申请国家发明专利10余项，授权6项，成果转化2项，发表SCI论文60余篇（其中以第一作者或通讯作者发表SCI论文30余篇，ESI高被引论文2篇，论文被引2500余次，h-index 27），出版英文专著1部，参与撰写英文专著5部，入选“2022年全球2%顶尖科学家”榜单。《Frontiers

in Chemistry》、《Molecules》和《Biosensors》杂志客座主编。

Enhanced SERS aptasensor for sensitive detection of saxitoxin based on HAuCl4/H2O2 reaction system and Pt/Au nanozyme

Yueqing Li, Xuemei Tang, Wei Zeng, Ting Wu, Long Wu*

Key Laboratory of Tropical Fruits and Vegetables Quality and Safety for State Market Regulation, School of Food Science and Engineering, Hainan University, Haikou 570228, China

*Corresponding author.

Abstract

Saxitoxin (STX) is a marine biotoxin produced by cyanobacteria and methanobacteria, which is harmful to humans and aquatic organisms. Therefore, it is urgent to establish an efficient, sensitive and selective method for the screening of STX. In this paper, based on the HAuCl4/H2O2 reaction system, gold nanoparticles (Au NPs) decorated Fe3O4 magnetic beads (Fe3O4@Au NPs) and Pt/Au nanozymes (Pt/Au NZs), an improved surface-enhanced Raman scattering (SERS) aptasensor was proposed for sensitive and selective detection of STX. Firstly, SERS tag (4-mercaptobenzoic acid) and aptamer modified Fe3O4@Au NPs were hybridized with complementary DNA modified Pt/Au NZs (Pt/Au-cDNA) to form the specific complexes. Wherein, aptamer acted as capture agent to specifically recognize STX, Pt/Au NZs catalyzed HAuCl4/H2O2 reaction to enhance SERS signal, and Fe3O4 facilitated the magnetic separation and simple detection operations. The SERS aptasensor achieved sensitive detection of STX with a wide linear range from 0.02 to 0.8 μmol/L and a low limit of detection (LOD) of 13 nmol/L (signal-to-noise (S/N) = 3). To evaluate the performance of this method, STX were detected in the spiked seafood samples with recoveries from 78.75% to 150% with relative standard deviation below 6.52%. Besides, the SERS aptasensor behaved good stability and repeatability, revealing its promising potential in STX detection and food safety detection.

Reference:

LI Y Q, TANG X M, ZENG W, et al. Enhanced SERS aptasensor for sensitive detection of saxitoxin based on HAuCl4/H2O2 reaction system and Pt/Au nanozyme[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(8): 9250186. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250186.

本文编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：摄图网

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