《食品科学》：华南农业大学杨美艳副教授等：4个噬菌体裂解酶的克隆表达及活性分析

食源性致病菌污染是威胁食品安全的核心问题之一。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）作为典型的革兰氏阴性菌与阳性菌，可引发严重的食物中毒，且其耐药性持续增强，亟需开发新型抗菌策略。抗生素的使用也会导致多重耐药菌的出现，而噬菌体疗法正好可以规避这一现象。噬菌体是一种能够特异性侵染细菌的病毒，在地球上分布广泛，是最丰富的生物体，其数量至少是细菌的10 倍。噬菌体是由蛋白质外壳和遗传物质组成的病毒，根据尾部形态特征可将噬菌体分为有尾噬菌体和无尾噬菌体，目前噬菌体大部分都为有尾噬菌体。近期研究发现长期噬菌体-细菌共培养可诱导抗性菌株演化，此现象限制了单一噬菌体疗法的可持续性。值得注意的是，噬菌体在感染周期的末期会表达一种关键的酶——裂解酶，它正是实现细菌裂解的关键效应分子。噬菌体裂解酶，又称为内溶素，于1958年被Jacob等发现，其通过特异性水解细菌细胞壁肽聚糖实现高效杀菌，兼具靶向性强、不易诱发耐药性等优势，已成为一种极具潜力的抗菌剂。

因为革兰氏阴性菌和阳性菌的细胞壁存在一定差异，所以噬菌体裂解酶的结构特征也受其宿主细胞壁性质的影响。其中，革兰氏阳性菌裂解酶通常呈现模块化多域架构：其N端为高度保守的催化结构域（CD），负责肽聚糖水解活性；C端为细胞壁结合结构域（CBD），通过识别宿主特异性底物决定酶的选择性。两者由肽衔接，部分酶甚至含多个CD或CBD模块。值得注意的是，CD作为活性中心不可或缺，而CBD通过锚定细胞壁限制酶扩散，从而精准调控裂解范围。相较之下，革兰氏阴性菌裂解酶多呈单域球状结构，仅保留CD。基于上述结构特性与高效杀菌能力，裂解酶已在食品保鲜、畜牧养殖及临床治疗等领域展现出应用潜力。例如，将被污染的生菜浸泡在含PlyEc2的溶液中1 h能杀死生菜表面99.7%致病菌且不影响生菜的食用口感；裂解酶ClyL与头孢喹肟联用处理公猪精液，可协同杀灭细菌并维持精子活力，使母猪子宫内膜炎发生率降至0%，为人工授精卫生管理提供新策略；裂解酶PlyB可在体外快速杀灭营养态蜡样芽孢杆菌，并在两种眼部感染模型中安全、有效地阻止其致盲性破坏，为耐药菌所致眼内炎和角膜炎提供了全新的替代治疗方案。

华南农业大学食品学院的叶文鑫、何嘉欣和杨美艳*等人基于组内前期分离得到的10 株革兰氏阴性菌噬菌体与4 株革兰氏阳性菌噬菌体，经全基因组注释挖掘得到裂解酶基因，成功克隆表达出2 种具有体外抑菌活性的蜡样芽孢杆菌噬菌体裂解酶LysLY1和LysLY3的粗酶蛋白，以及经过纯化的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶LysCA8和LysBA3，并初步评价其酶学特性，以期为后续开展裂解酶的结构与功能研究及抗菌制剂的开发提供理论基础和实验依据。

1 噬菌体裂解酶蛋白的生物信息学分析

1.1 裂解酶基因序列分析

从实验团队的噬菌体资源库中，选取14 株噬菌体（FR3、HDB2、CA8、BA3、BA6、FE11、DE10、DE17、AC2、G1、LY1、LY3、CC、CS）进行基因组注释，其裂解酶蛋白预测如表2所示。

1.2 裂解酶结构域预测

为进一步解析裂解酶的结构特征与功能基础，本研究首先对15 个候选裂解酶进行了结构域预测。结构域分析可揭示裂解酶的催化中心类型，从而推测其对不同宿主细胞壁的识别模式和裂解机制。通过InterPro对裂解酶进行结构域预测，结果显示：LysFR3在第57～118位氨基酸处包含Peptidase_M15A_3结构域；LysHDB2、LysBA6和LysLY3均包含Lyz-like结构域，分别位于第37～184位、120～209位和第5～149位氨基酸处；LysCA8被预测为N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，并在第3～126位氨基酸处存在Amidase_2催化结构域；LysBA3、LysCC和LysCS也均存在Amidase_2催化结构域，分别位于第3～26位及第46～175位（LysCC和LysCS）氨基酸处；LysFE11、LysDE10-1和LysDE17均包含Peptidase_M15A_3结构域，分别位于第28～89位、28～89位和第27～89位氨基酸处；LysDE10-2被预测为肽酶，LysLY1被预测为N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，其结构域分别位于第13～256位和第7～171位氨基酸处；LysAC2包含两个Zn依赖性肽酶结构域，分别位于第13～75位和第83～255位氨基酸处；LysG1则在第55～168位氨基酸处包含Lyz-like结构域。

1.3 裂解酶理化预测

为评估蛋白在异源表达系统中的稳定性与可溶性，为后续的表达纯化策略优化提供数据支持，利用软件ExPASy-ProtParam Tool分别对裂解酶的理化性质进行预测。不稳定指数＜40时为稳定蛋白，平均亲水性＜0时被认为是可溶性蛋白，如表3所示，除了LysG1外，其余14 个均为稳定蛋白；15 个蛋白均为亲水性可溶性蛋白。

2 噬菌体裂解酶蛋白的克隆表达与纯化

2.1 裂解酶基因片段的PCR扩增

提取噬菌体DNA，以其为模板，进行PCR扩增。凝胶电泳结果如图1所示，FR3、CA8和BA3目的基因在500 bp左右有明亮条带，FE11、DE10-1、DE17目的基因在400 bp左右有明亮条带，BA6、LY1、LY3目的基因在750 bp左右有明亮条带，HDB2和G1目的基因在550 bp左右有明亮条带，DE10-2、AC2、CC、CS目的基因在1 000 bp左右有明亮条带，均与其理论目的基因碱基数基本相符，因此判定以上15 个噬菌体裂解酶基因成功扩增。

2.2 阳性转化子的鉴定

分别将BL21/pET-28a-LysAC2/BA3/BA6/CA8/CC/CS/DE10-1/DE10-2/DE17/FE11/FR3/G1/HDB2/LY1/LY3的单克隆作为模板进行菌落PCR鉴定，结果如图2所示，pET-28a-FR3、pET-28a-CA8和pET-28a-BA3在800 bp处有相应条带，pET-28a-FE11、pET-28a-DE10-1、pET-28a-DE17应在700 bp处有相应条带，pET-28a-BA6、pET-28a-LY1、pET-28a-LY3在1 000 bp处有相应条带，pET-28a-HDB2、pET-28a-G1在850 bp处有相应条带，pET-28a-DE10-2、pET-28a-AC2、pET-28a-CC、pET-28a-CS在1 300 bp处有相应条带，片段大小正确，同时重组质粒测序结果表明，裂解酶基因已转入表达菌株BL21（DE3）中。

2.3 重组蛋白的表达纯化与检测

由图3可以看出，使用1 mmol/L IPTG进行诱导后，LysCA8、LysBA3、LysFE11、LysDE10-1、LysDE10-2、LysAC2的目的条带与理论值一致，因此认为其成功表达。

上述可表达蛋白经ÄKTA系统亲和层析后仅成功获得了裂解酶LysCA8和LysBA3的纯化蛋白，结果如图4所示。

3 噬菌体裂解酶的酶学特性分析

3.1 副溶血性弧菌噬菌体裂解酶的酶学特性分析

3.1.1 副溶血性弧菌噬菌体裂解酶的裂解活性验证

选择了30 株包含12 种血清型的副溶血性弧菌对纯化后的裂解酶LysCA8和LysBA3（均为革兰氏阴性菌裂解酶）的裂解活性进行点样测定。结果显示，裂解酶LysCA8和LysBA3在经PBS处理和经EDTA处理的副溶血性弧菌平板上点样，均未观察到裂解斑的出现，表明两个裂解酶对供试菌株均无裂解能力。为进一步验证裂解酶的裂解活性，通过OD600值的变化探究LysCA8和LysBA3的裂解活性。如图5所示，添加了裂解酶LysCA8和LysBA3的PBS处理组与对照组相比，OD600未见明显差异；添加了裂解酶LysCA8和LysBA3的EDTA处理组与对照组相比，OD600未见明显差异，初步判断LysCA8和LysBA3无裂解活性。

3.1.2 不同温度对裂解酶裂解活性的影响

将裂解酶与菌液混合，观察在不同温度条件下OD600变化。如图6所示，20、25、37、45 ℃条件下，添加了LysCA8的4 个实验组之间的OD600无明显差异，且与对照组曲线基本一致，说明不同温度对LysCA8的裂解活性无增强作用。添加了LysBA3裂解酶的实验组也得到相同结果，裂解酶依然对宿主菌无杀菌活性。

3.1.3 不同金属离子对裂解酶裂解活性的影响

有研究表明，有的裂解酶属于金属依赖性酶，金属离子的加入可能会影响裂解酶的活性。因此探究不同金属离子溶液对裂解酶活性的影响。如图7所示，分别使用10 mmol/L Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+溶液处理细菌，结果表明，Na+溶液处理组中，添加了裂解酶LysCA8和LysBA3的实验组与对照组OD600值无明显差异，在Mg2+、 Ca2+、Zn2+溶液处理组中，呈现的结果也与上述一致，说明金属离子对LysCA8和LysBA3的裂解活性无激活作用。

3.1.4 不同离子浓度对裂解酶裂解活性的影响

如图8所示，分别使用100、10、1 mmol/L Zn2+溶液处理细菌，结果表明，在不同浓度Zn2+处理组中，添加了裂解酶LysCA8和LysBA3的实验组与对照组的OD600未见明显差异，因此认为不同浓度的Zn2+溶液对LysCA8和LysBA3的裂解活性无增强作用。

3.2 蜡样芽孢杆菌噬菌体裂解酶的活性验证

如图9所示，LysLY1和LysLY3均在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达，经1 mmol/L IPTG诱导后在泳道3和泳道5处观察到与理论分子质量相符的表达条带，而LysCC和LysCS未见表达。由于LysLY1和LysLY3在纯化过程中蛋白产率较低，尚未获得纯化条带，故本研究暂以粗酶蛋白用于后续裂解谱验证。

选择89 株蜡样芽孢杆菌对噬菌体vB_BceS_LY1、vB_BceP_LY3及其裂解酶LysLY1、LysLY3进行了裂解谱鉴定。如图10所示，vB_BceS_LY1和vB_BceP_LY3分别仅能裂解其中的3 株和2 株；而裂解酶LysLY1和LysLY3则能裂解全部89 株供试蜡样芽孢杆菌。这表明裂解酶LysLY1和LysLY3相较于其来源噬菌体vB_BceS_LY1和vB_BceP_LY3，具有显著更宽的裂解范围。

讨论与结论

植物和动物细菌性感染主要分别依赖于化学药剂和抗生素治疗，近年来由于它们长期大量使用，细菌耐药性不断增强，已成为一个日益严重的问题，给公共卫生安全带来了严峻挑战。如果不加以控制，到2050年，每年将有超过1 000万 人死于耐药性细菌感染。噬菌体和其裂解酶已被证明具有优秀的抗菌性能，在治疗耐多药细菌方面有良好的应用前景。噬菌体裂解酶可以直接作用于革兰氏阳性菌细胞壁上的肽聚糖，引起细胞裂解，但是由于革兰阴性菌细胞壁表面有一层外膜作为屏障，裂解酶不能够直接穿透外膜作用于肽聚糖。因此，需要用外膜渗透剂对细菌进行预处理。截至2025年7月，在NCBI上搜索到关于裂解酶蛋白的数据有14 618 条，仅文献报道的裂解酶有100多个。裂解酶在对抗多重耐药菌方面潜力巨大，但其活性表现具有显著的菌型依赖性，尤其受制于革兰氏阴性菌（G-菌）的外膜屏障。本研究中，源自副溶血性弧菌噬菌体的LysCA8和LysBA3裂解酶，尽管生物信息学预测其具备肽聚糖水解活性，但在体外实验中对靶菌无裂解活性。推测LysCA8和LysBA3的失活主要系其单域结构未能有效穿透细菌外膜所致。这一发现并非个例，而是革兰氏阴性菌噬菌体裂解酶研究中面临的普遍挑战。例如，假单胞菌噬菌体的裂解酶ΦPsa374，尽管具有肽聚糖水解酶活性域，但其自身对宿主菌Psa不具备内在的体外抗菌活性。只有当该内溶素与能够穿透外膜的肽段（如信号肽、OMP结构域）进行基因融合后，才能展现出有效的体外杀菌能力。铜绿假单胞菌噬菌体裂解酶L0782只有在与具有膜渗透能力的PCNP肽段进行融合后，才能穿透革兰氏阴性菌的外膜，获得高效的体外裂解活性。通过将噬菌体T5的裂解酶与能够靶向宿主外膜蛋白的受体结合蛋白进行融合后能够显著提高裂解酶对抗革兰氏阴性菌的体外杀菌效力，同时拓展了针对多种革兰氏阴性细菌的宿主范围。相比之下，那些具备显著活性的G-菌裂解酶，在结构和作用模式上体现了对外膜屏障的有效穿透能力。例如，PlyKp104通过其独特的C端两亲性α螺旋结构，实现了在无需外膜通透剂的情况下对MDR肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等ESKAPE病原体的高效裂解活性，证明了通过引入外膜破坏结构域可以赋予裂解酶独立穿透细菌外膜的能力。类似的，LysSS的C端有一个带有6 个带正电荷的氨基酸区域，使其对耐多药的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌表现出高效的裂解活性验证。另一种有效的策略是采用协同辅助机制，LysST-3在体外实验中需要与其相应的穿孔素HolST-3联用才能发挥高效杀菌作用，证明了这种协同辅助组分在裂解酶穿透外膜方面的关键作用。综上所述，LysCA8和LysBA3的研究结果强调了裂解酶设计中外膜穿透机制的决定性地位，未来的研究应集中于构建嵌合酶，借鉴PlyKp104等成功案例的经验，引入高效的外膜破坏结构域，或者构建穿孔素-裂解酶的二元裂解系统，以期将噬菌体裂解酶转化为高效绿色的新型抗菌剂。

值得注意的是，裂解酶LysLY1和LysLY3相较于其来源噬菌体vB_BceS_LY1和vB_BceP_LY3展现出显著更宽的裂解范围，这一现象可能与裂解酶与噬菌体在作用机制上的差异密切相关。噬菌体感染需要识别并结合宿主表面特异性受体，这一步骤具有高度选择性，因此噬菌体的宿主范围通常较窄。而裂解酶能够在不依赖受体识别的前提下，仅需酶的CD与细胞壁底物结合即可发挥杀菌作用。特别是革兰氏阳性菌的细胞壁结构相对暴露，裂解酶易于接触并水解肽聚糖，因此具有更大的宿主谱可能性。此外，LysLY1预测包含Amidase催化结构域，可能具有较强的底物适应能力，这也为其广谱活性提供了结构基础。

目前关于裂解酶表达纯化后没有活性的原因尚未有明确定论，结合上述报道，推测产生这种现象可能有以下几种原因：

1）在表达纯化过程中，蛋白可能在某些因素的影响下，稳定的构象被破坏，失去了生物活性。强酸、强碱、温度、紫外线照射、剧烈振荡等都可能使蛋白质变性聚集。

2）裂解酶可能与表达菌株或质粒所表达的蛋白相互作用之后才会产生抑菌作用。有研究发现加入分子伴侣，特别是噬菌体伴侣蛋白，能够增加重组蛋白的耐受性、提高质量和产量，避免蛋白聚集。因此在后续的研究中可以加入分子伴侣以探究其能否使裂解酶具有活性。

3）裂解酶可能在杀菌过程中没有表现出吸光度的变化，因此浊度法不能够体现出裂解酶的裂解活性。有实验表明，肠杆菌噬菌体myPSH1140裂解酶Gp105通过浊度法只观察到光密度值停滞而不是降低，但通过肽聚糖水解实验Gp105却被证实对革兰氏阴性菌具有广谱抗菌活性。

本研究基于课题组前期分离获得的14 株新型烈性噬菌体（包括10 株革兰氏阴性菌噬菌体和4 株革兰氏阳性菌噬菌体），通过全基因组注释挖掘获得裂解酶基因，并成功克隆表达了其中4 种裂解酶。结果表明，副溶血性弧菌噬菌体裂解酶LysCA8和LysBA3虽经纯化获得，但在多种实验条件下均未表现出裂解活性；而蜡样芽孢杆菌噬菌体裂解酶LysLY1和LysLY3虽仅获得粗酶蛋白，但展现出对供试89 株菌株的广谱裂解活性，且其裂解范围明显超过其来源噬菌体。这一现象可能与裂解酶不依赖宿主表面受体识别、可直接作用于细胞壁肽聚糖有关。本研究初步验证了来源于噬菌体的裂解酶在体外的表达及其裂解活性，为后续开展裂解酶的结构功能研究和抗菌制剂开发提供了理论依据和实验基础。针对副溶血性弧菌噬菌体裂解酶LysCA8和LysBA3纯化后无活性的问题，后续考虑通过加入分子伴侣，单独表达CD，设计嵌合裂解酶等方法进一步对裂解酶活性进行研究。

作者简介

通信作者：

杨美艳，副教授，华南农业大学食品学院硕士生导师，先后于加拿大McGill University和广东省科学院从事博士后研究。主要聚焦噬菌体替抗和新食物资源开发研究，包括食源性或农业致病菌噬菌体资源挖掘、噬菌体分类鉴定、噬菌体生物信息学分析、微生物分子进化学、肠道宏病毒组学、噬菌体裂解酶及宿主识别机制、微生物蛋白和昆虫蛋白研究，发表SCI文章30余篇，申请或授权国家发明专利7 件。主持国家自然科学基金、十四五重点研发子课题、广东省科技计划国际合作项目、广东省重点领域研发专项子课题、广东省农业厅推广项目、广州市重点研发以及企业委托项目十余项，参与广东省基础研究与应用基础研究重大项目1 项，主持横向课题及其他项目多项。

第一作者：

叶文鑫，华南农业大学食品学院生物学专业硕士生，研究方向为噬菌体的宿主识别机制。

引文格式：

叶文鑫, 何嘉欣, Vivian Montero ALEJO, 等. 4 个噬菌体裂解酶的克隆表达及活性分析[J]. 食品科学, 2026, 47(9): 128-137. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250923-183.

YE Wenxin, HE Jiaxin, Vivian Montero ALEJO, et al. Cloning, expression and activity analysis of four bacteriophage lysins[J].Food Science, 2026, 47(9): 128-137. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250923-183.

实习编辑：杨瑞蕾；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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