Nat. Synth.｜机器学习赋能蛋白质工程实现多手性中心手性醇全部立体异构体的精准合成

来源：市场资讯

（来源：吴起团队 DrugAI）

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遇见·摘要

近日，浙江大学吴起团队与英国贝尔法斯特女王大学黄美兰博士团队合作，在国际权威期刊Nature Synthesis发表题为 "Access to all stereoisomers of chiral alcohols with multiple stereocentres enabled by machine learning-empowered protein engineering" 的研究论文。该工作发展了一种融合理性设计与机器学习的酶工程策略（BioStrucTag），成功将单一醇脱氢酶改造为一组立体互补的突变库，实现了含三个手性中心的醇类化合物全部八种产物异构体的精准合成，为多手性中心化合物的立体发散合成提供了全新平台。

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遇见·内容

一、多手性中心立体发散合成：挑战与机遇并存

手性分子的三维空间构型直接决定其生物活性与功能，在药物、农药及功能材料领域具有不可替代的地位。然而，含有多个手性中心的化合物的立体选择性合成，尤其是面向全部可能立体异构体的发散性制备，始终是有机合成化学中的核心难题。依据Le Bel–van’t Hoff规则，分子中手性中心数目每增加一个，立体异构体数量即呈指数增长——三个手性中心对应八种可能的构型。传统化学催化方法往往需要为每种目标构型设计独立的催化体系，难以实现单一催化剂对所有异构体的精准控制。

在生物催化领域，借助定向进化改造酶的立体选择性已取得显著进展。然而，将单一酶进化为覆盖全部立体异构体的“立体互补工具箱”，尤其是针对三个及以上手性中心的产物，仍面临两大瓶颈：其一，酶活性中心的立体化学调控需要极其精细的结构修饰，进化任务对应的序列空间极为庞大，导致突变体立体选择性的实验筛选成本难以承受；其二，仅基于序列编码的机器学习模型难以捕捉酶-底物复合物活性口袋预反应构象的空间特征，导致立体选择性预测精度受限（图1）。

图1. 多手性中心手性醇的立体发散合成挑战

含季碳中心的五元环及六元环的1,3-环二醇与β-羟基酮是众多天然产物合成中的关键手性砌块。通过2,2-二取代环二酮的去对称化还原，是构建该类骨架最直接、最有效的途径。然而，在该反应中同时控制多个手性中心的立体化学，尤其是实现含三个手性中心的二醇产物的全部异构体合成，仍是极具挑战性的课题。

二、BioStrucTag机器学习框架：精准导航酶定向进化

针对上述挑战，本研究开发了融合聚焦理性迭代定点突变（FRISM）理性设计与机器学习的酶工程框架——BioStrucTag（图1c）。该框架通过三维体素化网格对酶催化口袋的结构特征进行表征，捕捉与特定手性产物对应的预反应状态下的活性中心空间结构信息；同时，整合基于Transformer架构的蛋白质语言模型（ESM2）所提取的酶序列特征。两类特征经融合后输入回归模型，以FRISM策略产生的实验数据训练，用于预测新突变体对目标构型的立体选择性。每轮预测中，按照模型输出分值对候选突变体降序排列，选取前五名进行实验验证；新获取的数据随即加入训练集，迭代优化模型性能。一轮筛选完成后，以当前最优突变体为模板，开展下一轮预测–验证循环，直至获得满足要求的理想突变体。

研究选取2-甲基-2-苄基-1,3-环戊二酮（1a）为模型底物，以来源于短乳杆菌（Lactobacillus brevis）的醇脱氢酶（LbADH，PDB 1ZK4）作为改造模板。该底物含有两个羰基，部分还原可生成4种β-羟基酮，完全还原则生成8种理论上的1,3-环二醇异构体（因对称性合并为4种），共计8种目标产物（图1d）。团队首先基于FRISM策略对11个热点残基进行定点突变，经过少量的筛选即获得三种高选择性突变体：M2RR（E144F/V195R）专一生成(2R,3R)-2a（99.5%选择性）；M2SS（E144T/V195G）专一生成(2S,3S)-2a（98.2%选择性）；M2SR（A93Y/L194M/V195G）专一生成(2S,3R)-2a（95.3%选择性）。而针对(2R,3S)-2a的选择性最高只达到70%。针对这一最难靶点，团队利用BioStrucTag框架：以FRISM获得的四突变体I143G/E144G/Y189A/Y248A（70%选择性）为起点，首轮预测引入第五突变位点（M205A），获得84%选择性；将新数据加入训练集后开展第二轮预测，筛选出的突变体GLAAA（I143G/E144L/Y189A/M205A/Y248A，M2RS）将选择性提升至98.2%，全程仅实验验证10个变体。

二醇产物的合成涉及连续两步还原，中间体需在酶活性口袋中发生构象翻转，难度更高。研究团队以GLAAA为起点，利用BioStrucTag进行三轮迭代预测，通过引入第六至第八位突变，获得M3RrS（GLAAAC/L194M/N95H），对(1R,2r,3S)-3a的选择性达90.4%。类似地，以E144G为起点经两轮ML引导，获得M3RsS（N95P/E144G/M205A），对(1R,2s,3S)-3a的选择性达91.6%。另外两个二醇构型由M205A（M3RR）和I143G/E144G/Y189A/Y248L（M3SS）分别以95.7%选择性获得。至此，全部八种立体异构体被八种突变体逐一精准合成（图2)。

图2. LbADH的立体发散性改造，实现三手性中心手性醇全部8种立体异构体的制备

研究进一步揭示了酶活性口袋中的“立体汇聚”机制：同一种二醇产物可通过两条不同的还原路径生成。以（1R,2r,3S)-二醇为例，底物1a可先以pro-(2R,3S)构象被还原、再以pro-(2S,3R)构象被还原；亦可先以pro-(2S,3R)构象被还原、再以pro-(2R,3S)构象被还原。只要酶的活性中心能够同时容纳β-羟基酮中间体的两种对应结合构象，并对这两种中间体均保持催化活性，即可经立体汇聚途径得到单一构型的二醇产物。该机制通过使用四种最优β-羟基酮突变体直接还原四种光学纯的β-羟基酮（2a），得到了实验验证（图3）。

图3.二醇形成过程中的立体汇聚途径

三、结构基础与分子机制解析

为阐明立体选择性调控的分子机制，研究团队解析了突变体的晶体结构（M2SR：PDB 9VMS；M2RS：PDB 9VMT），并结合分子动力学（MD）模拟开展了系统分析（图4）。结果表明，立体选择性的精细切换由两方面因素协同调控：一是特定突变引起的底物在活性口袋中的重新定位；二是由残基191–205组成的柔性环区（SC-loop）在开放与闭合构象之间的动态转换。SC-loop在不同构象的二酮底物及β-羟基酮中间体的诱导下，可在开放与闭合状态之间相互转换，从而优化底物结合稳定性与反应选择性。具体而言，当SC-loop处于闭合构象时，有利于C2位形成R构型；而当引入V195G等突变使SC-loop倾向于开放构象时，则为底物的芳环提供了更大的容纳空间，促使底物发生翻转，从而优先形成C2位的S构型。二醇的生成则依赖于两个还原步骤中底物结合构象的精确衔接，从而在三个手性中心上实现立体化学的同步确立。

动力学参数测定结果显示，突变体M2RS对(2R,3S)-2a的催化效率是副产物对映体的377倍；M2RR、M2SS与M2SR仅对各自优势构型产物检测到活性。上述实验数据与MD模拟结果高度一致，这些结果与晶体结构和分子动力学模拟的发现高度一致，揭示了增强立体选择性切换的分子基础。

图4.代表性突变体的活性口袋构象及动力学参数

四、底物适应性与合成应用潜力

在获得最优突变体后，团队进一步考察了底物范围。结果表明，四种立体互补的β-羟基酮突变体和四种二醇突变体均表现出良好的底物适用性，能够适应苯环上不同位置及电子效应（甲基、甲氧基、硝基、氟、溴、碘、萘基等）的取代基，以及五元环和六元环骨架的环二酮底物。产物的非对映体比值与对映体比值普遍达到99:1（图5、图6）。此外，研究还进行了克级规模放大实验，产物分离收率良好，且立体选择性保持不变（>99:1 d.r.，>99:1 e.r.），充分证明了该方法在合成应用中的可行性与实用价值。

图5. 四种最优立体互补β-羟基酮突变体的底物谱

图6.四种最优立体互补1.3-环二醇突变体的底物谱

五、总结

本研究建立了机器学习赋能的蛋白质工程新策略，成功将单一醇脱氢酶LbADH改造为一套立体互补的突变体家族，首次实现了二酮还原生成的含三个手性中心手性醇全部八种构型产物的酶促合成。该工作不仅拓展了立体发散性生物催化的边界，也为多手性中心化合物的绿色、高效合成提供了新的平台技术。这一突破得益于高效的FRISM（半）理性策略和理性设计/机器学习相结合的BioStrucTag框架对酶活性中心的三维结构信息与蛋白质语言模型编码的序列特征的有效融合，使研究者能够在庞大的序列空间中精准定位最优突变组合，极大提升了定向进化的效率。随着人工智能与合成生物学的深度交叉融合，该策略有望推动更多酶催化反应的开发与应用。

本研究得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、浙江省自然科学基金、中国博士后科学基金等项目的资助。浙江大学吴起教授、徐维华博士，英国贝尔法斯特女王大学黄美兰博士、以及上海中医药大学岑一欣助理研究员为论文共同通讯作者。浙江大学鲁振宇博士与贝尔法斯特女王大学周家辉博士为论文共同第一作者。

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遇见·致谢

感谢吴起老师团队对本号的支持！

文章链接：https://doi.org/10.1038/s44160-026-01144-y