Nature | 无需参考基因组！Malva平台实现单细胞数据超快序列检索，涵盖约7400万个细胞

近年来，随着单细胞和空间转录组学技术的蓬勃发展，人类细胞图谱等大型项目每年产生PB级的序列数据，为理解细胞异质性、疾病机制和生物多样性提供了前所未有的资源。但现有现有细胞图谱平台仅能提供基于参考基因组的基因与转录本计数矩阵，丢失原始序列信息，无法检测未比对参考序列的转录本、RNA编辑、突变等关键信息；标准单细胞分析流程仍以参考序列为中心，处理海量原始数据需巨大计算资源。基于k-mer索引的批量样本搜索工具虽能实现快速序列检索，但其内存和扩展性无法应对数千万个单细胞的数据规模。因此，目前亟需一种能整合碎片化单细胞数据、高效搜索任意RNA序列的新工具，填补现有技术空白。

近日，德国柏林Max Delbrueck分子医学中心-系统生物学研究所（MDC-BIMSB）的研究团队开发了名为Malva的计算平台，可对单细胞、单细胞核以及空间转录组数据开展无参考基因组、物种无关的超快序列查询。Malva基于k-mer索引策略，构建持续更新的Malva索引库，已收录约7400万个来自健康与疾病研究的细胞数据，支持核苷酸序列、基因ID、自然语言三类输入，可检索任意序列、突变、剪接连接点、病原体或任意转录本，同时输出细胞类型、空间位置等信息。Malva不仅可完成序列检索，还支持无参考发现，即直接从序列组成识别细胞类型并预测细胞间相似性。基准测试证实，Malva平台索引、查询性能优于现有工具，定量结果与传统比对流程高度吻合。总之，Malva将单细胞图谱从静态基因计数表转变为动态的序列解析的资源，为单细胞大数据挖掘与AI生物学分析提供全新支持。

Malva由新型检索算法、持续扩展的可搜索语料库（Malva Index）及公共API三部分构成，解决单细胞大数据分析的三大难点：保留核苷酸分辨率、跨研究数据协调及远程访问、无需本地下载原始测序数据。Malva采用改进的k-mer索引策略，通过非重叠k-mer采样、稀疏倒排列表和样本独立索引+增量合并，实现了内存高效和持续扩展的索引构建。平台提供序列、覆盖度（基因组区间）、自然语言等三类检索模式，用户可沿特征、检索范围（组织、疾病状态等）、测量方式和规模等4个维度进行检索。

基于Stereo-seq小鼠肝脏图谱，研究团队评估了Malva性能，该图谱包含20个切片、约610亿条reads。结果显示，Malva在24个CPU小时内完成索引，速度较其他预处理流程提升425倍，峰值内存占用仅8 GB；查询延迟较低，单k-mer检索需70 ms，1 kb转录本检索约0.9 s，1000个转录本检索约1分钟（单核），所有计算均为即时响应。与当前最优的k-mer工具Fulgor相比，Malva索引更快、内存更小，且查询吞吐量相当。在定量准确性上，Malva输出的伪计数在细胞水平、基因水平与常规比对流程的基因计数呈现强相关性，并完整保留了细胞类型差异表达特征、空间组织结构、细胞类型分离及发育轨迹。在7种细胞系变异检测基准中，Malva索引速度比Flexiplex快4倍且保持高灵敏度与特异性，并能准确检测肺癌队列中的肿瘤驱动突变。

图1. Malva支持跨单细胞图谱的即时序列查询

在完成性能验证后，研究团队整合超140TB公共单细胞、空间转录组数据构建Malva索引库，耗费约9700小时CPU算力；该索引库目前收录5100万人类细胞、1000万小鼠细胞，覆盖胚胎、成人、疾病样本，涵盖人类主要器官系统、多种测序技术。特别地，研究团队还开发了爬虫程序，持续从HCA数据门户及NCBI SRA、GEO、ENA、CNGBdb等收集FASTQ文件，提取条形码或空间坐标，索引并合并至统一的Malva Index中。截止2025年5月，Malva索引覆盖约80% HCA数据，约20%的SRA人类单细胞测序数据集存储体积仅为原始文件的10%。Malva索引库可以实现超高速查询，短序列探针（如24-mer）仅需毫秒，全长cDNA耗时数秒，数千转录本仅需数分钟。

图2. Malva索引库Malva突破了传统单细胞图谱平台只能查询预定义基因计数的局限，实现了对任意序列、突变、异构体和病原体的即时搜索，无需重新处理海量原始数据。接下来，研究团队通过多个应用案例验证其性能。 研究团队构建包含病毒基因组、实验室常见污染物、内源性逆转录病毒以及实验载体的探针集，Malva检测出PhiX掺入物、支原体污染、HERV-K内源逆转录病毒和慢病毒载体，并能识别被样本健康注释掩盖的体外病毒感染细胞。在遗传变异检测方面，针对1KGP中29万余个常见编码区SNP设计探针，Malva在单细胞转录组数据中还原人群等位基因频率分布，可重现群体遗传结构。在异构体检测方面，该工具无需序列比对，依靠覆盖度信息成功识别可变剪接UTR变化。针对常规分析难以捕获的环状RNA，Malva依靠反向剪接连接点探针检索，实现环状RNA表达交互式分析，验证经典环状RNA CDR1as主要富集于兴奋性神经元。泛癌体细胞突变测试证实，Malva可跨多种肿瘤类型，高灵敏度、高特异性检出肿瘤相关变异，即使突变丰度极低无需重新比对或专用变异检测流程。上述结果表明，研究者仅通过Malva单一序列检索界面，便可在数百万细胞数据集上，从RNA表达、突变、异构体等多个功能维度开展无参考探索分析。

图3. Malva支持超出当前数据门户的序列级查询

传统单细胞聚类、轨迹推断依赖细胞基因计数矩阵，Malva拥有海量细胞kmer矩阵，但该矩阵特征维度达到数十亿，无法直接用于降维聚类。为此，研究团队将相似度相近的k-mer归并序列“桶”（buckets），构建维度可控的细胞bucket特征矩阵。

研究团队利用来自5000份健康样本约3000万个细胞验证该方案。结果显示，由细胞-序列桶矩阵生成的主成分结果与传统细胞-基因矩阵得到的结果具有可比性；在某些组织中邻域保留度和聚类相似度较高，在另一些组织中则显现出互补结构，表明基于序列的嵌入信息可作为基因层面分析的正交补充，能够发掘额外生物学结构，尤其适用于缺乏高质量参考基因组的非模式生物（如扁盘动物门）。

在人类肿瘤空间转录组中，序列桶聚类除可划分出肿瘤和基质等主要组织区域外，还鉴定出两个k-mer特异性空间簇（KS1和KS2），其在空间上分别位于组织边界内部和外部。研究团队从这些聚类中提取差异性k-mer并进行从头组装，仅用约1小时即可获得数千条连续序列（contigs）。约70%的contigs映射到已知基因，29%映射到基因间区；KS2聚类富集的contigs可映射至人rRNA序列，而KS1聚类富集的contigs可映射至多种口腔细菌的23S rRNA。这表明Malva在无需先验注释的情况下，能够无偏检测细胞类型特异的已知和未知序列特征。

图4. 无预定义基因注释的基于序列的转录组分析

Malva填补了单细胞大数据无参考序列快速检索工具空白，把细胞图谱从基因计数表格升级为可直接访问原始序列特征的动态资源。无需海量本地算力，科研人员即可跨大量数据集检索突变、剪接变体、外源核酸等传统手段难以挖掘的信号。Malva有望成为公共单细胞档案的基础检索范式，助力解析健康与疾病的分子机制。

参考文献：

https://www.nature.com/articles/s41586-026-10975-w

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