综述 | 肿瘤研究走到下一步：只看突变，为什么越来越不够？

过去二十年，肿瘤基因组研究通过识别大量驱动突变、拷贝数变异（CNV）和结构变异（SV），逐步建立了分子分型和克隆演化框架。但随着研究从肿瘤分型拓展到治疗反应、纵向演变和复发机制，单纯依赖突变谱的局限性日益显现。具有相似驱动事件的肿瘤可呈现不同的侵袭性、治疗反应和复发风险；同一克隆在不同微环境和治疗压力下可能进入完全不同的细胞状态。

因此，肿瘤演进不仅是遗传变异持续积累的过程，也伴随着细胞调控状态的动态重塑。仅比较变异谱往往难以区分克隆替换、细胞组成变化与同一克隆内的状态重塑。在肿瘤研究中需要同时观察两类互补信号：基因组变异主要提供克隆亲缘、分支和选择过程的线索；DNA甲基化则主要提供调控状态、细胞组成和环境响应的混合信息。

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基因组定义克隆骨架，甲基化补充细胞状态

发表于Nature Genetics的一项胶质瘤单细胞多组学研究，通过整合单细胞DNA甲基化谱、转录组以及bulk多组学数据发现，侵袭性强的肿瘤具有更明显的局部DNA甲基化紊乱；缺氧和放疗压力可进一步改变肿瘤细胞甲基化状态，诱导细胞状态转换。克隆演化分析显示，遗传改变能够影响细胞状态，但不能完全决定细胞的最终状态[1]。

由此看来，基因组更适合定义肿瘤的克隆“骨架”，DNA甲基化则可以描述克隆在不同环境和治疗压力下的状态变化。需要注意的是，差异甲基化位点并不一定都具有功能作用，也可能是疾病进展或细胞组成变化的结果，因此需要结合遗传背景和其他组学信息进行解释。

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癌前病变向恶性转化，不只是突变增加

癌前病变是基因组与甲基化联合分析的重要应用场景。一项结直肠癌研究比较了两类大小、组织学类型和异型增生程度相匹配的腺瘤：癌旁腺瘤（CAP）和无癌患者腺瘤（CFP）。WGS、RNA-seq和RRBS甲基化分析显示，与CFP相比，CAP不仅具有更多体细胞突变，还伴随更多异常基因表达和更广泛的高甲基化。APC变异在两组中均可见，TP53、FBXW7、PIK3CA、SMAD2等变异主要出现在CAP；整合分析进一步识别出124个在至少两个组学层面发生异常的基因[2]。

研究表明，病理形态相近的病变，分子演化阶段未必相同。两个在病理上同样被称为“腺瘤”的样本，向恶性阶段进展不仅涉及遗传变异的积累，也伴随调控状态重塑。因此，对正常或癌旁组织、癌前病变、早癌及进展期肿瘤进行连续阶段分析，并同步追踪基因和甲基化变化，有助于全面解析恶性转化过程。

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长期炎症留下的，可能不只是基因损伤

肝癌（HCC）提供了另一种典型联合分析场景。丙型肝炎病毒（HCV）感染可以通过抗病毒治疗清除病毒，但既往长期随访发现，HCV相关肝硬化患者获得持续病毒学应答（SVR）后，HCC风险仍可长期存在[3]。另一项研究发现，在肿瘤组织中，HCV组与SVR组共享91%的低甲基化区域和71%的高甲基化区域；在非肿瘤组织中，约三分之一的异常甲基化区域仍持续存在；并识别出同时具有甲基化异常和表达改变的一组转录因子及其下游基因[4]。

虽然上述结果并不足以证明持续性甲基化改变可直接导致HCC，但提示慢性刺激引起的部分调控改变，可能不会随着刺激消失而完全恢复。对于慢性炎症、病毒感染、肥胖、代谢异常或激素暴露相关肿瘤，纵向追踪基因和甲基化异常改变的形成、恢复和持续状态，经有助于了解后续疾病进展的分子背景。

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治疗耐受和复发涉及克隆和细胞状态变化

肿瘤治疗研究通常会关注耐药变异和复发风险。部分肿瘤在主要驱动事件未明显改变的情况下仍会进入耐药或复发状态。

前述胶质瘤单细胞研究显示，缺氧和放疗等环境压力可增加细胞的局部DNA甲基化紊乱，并伴随细胞状态转换；更高的甲基化异质性与更快的疾病进展相关[1]。表明肿瘤治疗研究不能只比较突变谱，否则会遗漏部分状态重塑的肿瘤细胞。

因此，肿瘤研究应同时关注两条轨迹：一是克隆轨迹，包括原有克隆扩增或消失以及新的SNV、CNV等遗传事件；二是状态轨迹，即相同遗传背景下甲基化状态的系统性改变；同时还应考虑肿瘤纯度、免疫细胞及基质比例变化对bulk甲基化结果的影响，即将克隆、细胞组成和调控状态的变化放到同一时间轴上解释。

05

空间异质性要求更加合理的取样设计

肿瘤空间异质性进一步增加了联合分析的复杂性。2017年一项局限期肺腺癌研究对11个肿瘤的48个空间分离区域进行了DNA甲基化分析，并与已有基因组数据比较。研究发现，同一肿瘤不同区域间，平均仅约25%的肿瘤相关差异甲基化探针在全部区域共享；相比之下，约77%的体细胞突变属于区域间共享事件[5]。 该研究提示，大部分共享突变可能代表相对早期发生的克隆事件，而部分肿瘤相关DNA甲基化改变可能出现在后续分支演化阶段。另一项肺腺癌研究在多区域原发肿瘤与匹配淋巴结转移灶中，同样发现了明显的区域间甲基化和拷贝数异质性，进一步提示空间取样对于理解肿瘤分子演化的重要性[6]。

对于耐药、侵袭前沿及空间异质性研究，取样区域本身就是研究设计的重要组成部分。多区域取样、病理标注、连续切片或激光捕获显微切割（LCM）可保留空间信息，再结合遗传和甲基化分析，有助于区分早期共享事件和后续分支事件。因美纳5-Base DNA Prep可同步检测基因和甲基化，但5-Base并非空间组学技术，其空间信息仍依赖取样设计，对于LCM等超低输入场景，也需单独验证其样本量和文库表现。

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从分型走向机制，同一份样本的联合检测

DNA甲基化早已被用于肿瘤分子分类。2018年，Capper等建立的中枢神经系统肿瘤（CNS）DNA甲基化分类体系证明，甲基化图谱能够提供传统形态学和部分基因组信息之外的分型依据，推动CNS肿瘤分类进一步走向分子化[7]。

但当研究开始关注肿瘤演进机制时，如何保证基因组和甲基化数据来自完全相同的生物学背景成为重要问题。既有研究常将WGS、RRBS、甲基化芯片及RNA-seq进行数据整合分析。对于样本充足的大型队列，当组学数据来自不同组织块、实验批次或时间点时，即使经过严格匹配，也可能产生生物学和技术层面的不确定性。而对于FFPE、cfDNA、微区组织、儿科肿瘤及珍贵的治疗前后样本，样本拆分可能进一步限制研究。

5-Base所做的正是从同一份样本获取两组信息。该试剂盒可从50–100 ng gDNA或1–20 ng cfDNA进行文库制备，并在同一份DNA中获得基因组序列及CpG 5mC信息，支持SNV、Indel及甲基化分析[8]。其主要价值并非简单增加一种检测，而是尽可能使克隆信息与调控状态来源于同一份DNA、同一时间点及相同实验背景，尤其适合需要同时解析遗传与表观信息、且样本相对珍贵的肿瘤研究。

07

联合分析适用场景与机制验证

从目前的研究逻辑看，5-Base更适用于需要同时解析遗传与5mC变化的研究场景。

需要注意的是，在同一份样本中同时发现变异和差异甲基化区域（DMR），并不能直接证明两者存在因果关系，至少还需完成四个问题的验证：

第一，发生改变的细胞类型。bulk肿瘤中的甲基化差异可能来自肿瘤细胞、免疫细胞、基质或肿瘤纯度变化。

第二，发生变化的时间顺序。横截面数据很难区分一个改变是癌变前已经存在，还是疾病进展的结果。

第三，变化的调控机制。遗传变异与DMR出现在相同区域，并不意味着前者必然驱动后者。

第四，功能验证。RNA、蛋白、染色质以及细胞或动物实验，仍是把相关性进一步推进到机制证据的重要步骤。

因此，更完整的肿瘤机制研究路径应是：

同一样本发现遗传＋甲基化异常→纵向或空间设计确定发生顺序和位置→RNA／蛋白建立功能关联→实验扰动验证机制

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总结

肿瘤研究正在从“肿瘤是什么”进一步转向“肿瘤为什么发生变化”。基因组信息能够解析克隆起源、分支和选择，DNA甲基化可补充细胞状态、环境响应以及可能存在的持续性调控。二者联合并非简单增加一个数据矩阵，而是将克隆变化与细胞状态改变置于同一个研究框架。

这正是5-Base在肿瘤研究中值得关注的地方。对于癌前病变、治疗耐受、复发和空间异质性或纵向液体活检等研究，5-Base提供了在同一样本中同时保留基因组与5mC的技术路径，提高了遗传与表观遗传信息的匹配程度，为进一步解析肿瘤演进机制提供更加一致的研究基础。

参考文献（滑动查看）

1.Johnson KC, Anderson KJ, Courtois ET, et al. Single-cell multimodal glioma analyses identify epigenetic regulators of cellular plasticity and environmental stress response. Nature Genetics. 2021;53:1456–1468. doi:10.1038/s41588-021-00926-8.

2.Druliner BR, Wang P, Bae T, et al. Molecular characterization of colorectal adenomas with and without malignancy reveals distinguishing genome, transcriptome and methylome alterations. Scientific Reports. 2018;8:3161. doi:10.1038/s41598-018-21525-4.

3.Aleman S, Rahbin N, Weiland O, et al. A risk for hepatocellular carcinoma persists long-term after sustained virologic response in patients with hepatitis C-associated liver cirrhosis. Clinical Infectious Diseases. 2013;57:230–236.

4.Sugimachi K, Araki H, Saito H, et al. Persistent epigenetic alterations in transcription factors after a sustained virological response in hepatocellular carcinoma. JGH Open. 2022;6:854–863. doi:10.1002/jgh3.12833.

5.Quek K, Li J, Estecio M, et al. DNA methylation intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas. Oncotarget. 2017;8:21994–22002. doi:10.18632/oncotarget.15777.

6.Dietz S, Lifshitz A, Kazdal D, et al. Global DNA methylation reflects spatial heterogeneity and molecular evolution of lung adenocarcinomas. International Journal of Cancer. 2019;144:1061–1072.

7.Capper D, Jones DTW, Sill M, et al. DNA methylation-based classification of central nervous system tumours. Nature. 2018;555:469–474. doi:10.1038/nature26000.

8.Illumina. Illumina 5-Base DNA Prep. Product information and technical documentation. 2026.

本文所述研究主要用于讨论肿瘤演进研究的设计思路。差异甲基化、基因组变异或双组学关联不等同于因果机制，也不代表已经建立的临床诊断、预后判断或治疗决策工具。

仅供科研使用，不用于诊断程序。

因美纳《表观新见》系列报道之“5-Base的儿童肿瘤ctDNA检测应用”

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