聚合物-脂质杂化纳米颗粒，最新Nature Materials！

CAR-T疗法的体外瓶颈与mRNA体内递送新思路

嵌合抗原受体T细胞疗法在癌症治疗中取得了革命性突破，但传统的CAR-T细胞疗法需要从患者体内分离T细胞，在体外进行复杂的基因工程改造和扩增，再回输给患者。这一过程涉及繁琐的工艺流程、高昂的成本和长时间的等待，严重限制了其可及性和临床应用范围。尽管基于信使核糖核酸的递送技术为绕开体外细胞操作提供了新思路，但现有的脂质纳米颗粒递送系统大多天然靶向肝脏，难以高效转染T细胞。为实现T细胞靶向，研究人员通常需要在纳米颗粒上偶联抗体，如抗CD3抗体，但这种策略可能诱发T细胞耗竭，影响治疗效果。

设计与优化——构建脾脏靶向的聚合物-脂质杂化纳米颗粒

针对上述挑战，厦门大学田华雨教授、方华攀副教授团队和山东省肿瘤医院陈小元教授合作，开发了一种名为ERTLNPs的聚合物-脂质杂化纳米颗粒（图1b）。这种新型递送载体无需任何抗体修饰，即可在静脉注射后优先靶向脾脏，并天然具备激活T细胞的能力。它通过IGF-1R和TM4SF5两条信号通路汇交于PI3K/AKT/mTOR信号轴，重编程T细胞代谢，促进其增殖并限制耗竭。负载成纤维细胞激活蛋白CAR编码mRNA的ERTLNPs，能够在体内原位生成功能性FAP CAR-T细胞，在肺纤维化、肝纤维化和胰腺癌模型中有效清除病理成纤维细胞，且脱靶效应极低。相关内容以“An inherent T cell-activating mRNA delivery carrier for in vivo CAR T generation”为题发表在《Nature Materials》上。

研究团队首先设计并合成了对甲苯磺酰精氨酸修饰的寡乙烯亚胺作为可电离聚合物组分（OEI-RT）（图1a）。他们将OEI-RT与辅助脂质DSPC、胆固醇、PEG-脂质DMG-PEG以及mRNA通过自组装方式，形成核壳结构的纳米颗粒ERTLNPs（图1b）。通过优化DMG-PEG的比例，他们发现含有20% DMG-PEG的配方表现最佳（图1c）。活体成像实验显示，静脉注射后，ERTLNPs介导的信使核糖核酸翻译具有高度的脾脏富集特性，脾脏占主要器官总生物发光的94.4%（图1d-f），这与常规SM102 LNP主要靶向肝脏的模式截然不同，有效降低了非靶器官的转基因表达风险。进一步研究发现，OEI-RT上RT接枝密度与体内转染效率呈正相关，45%接枝密度效果最优（图1g-i）。与其他多种改性聚合物（如鸟氨酸、精氨酸等）相比，ERTLNPs展现出最强的脾脏mRNA转染能力（图1j-k），证明了其独特的聚合物结构是实现高效递送的关键。

图1：ERTLNPs介导高效的体内mRNA递送。a, 可电离聚合物组分OEI-RT的合成路线。b, ERTLNPs的组成。c, 含有不同重量百分比DMG-PEG的ERTLNPs配方。d,e, 系统性给予负载Luc mRNA（记为mLuc）且含有不同重量百分比DMG-PEG的ERTLNPs（0.5 mg/kg mLuc）12小时后，C57小鼠主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的代表性离体图像(d)及生物发光定量(e)。f, 使用含有20% w/w DMG-PEG的ERTLNPs（记为20% ERTLNPs）在主要器官中转染效率的饼图分析。g,h, 系统性给予负载mLuc的、含有不同RT接枝数的OEI-RTs的ERTLNPs（0.5 mg/kg mLuc）12小时后，C57小鼠主要器官的代表性离体图像(g)及生物发光定量(h)。i, RT接枝水平与ERTLNPs体内转染性能增强之间关系的总结示意图。j,k, 系统性给予负载mLuc的ArgLNPs、OrnLNPs、Arg(NO2)LNPs、TosLNPs、Orn(Tos)LNPs或ERTLNPs（0.5 mg/kg mLuc）12小时后，C57小鼠的典型体内及离体图像(j)及主要器官生物发光定量(k)。数据以均值±标准差表示，n=3个生物学独立样本。P值通过单因素方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较检验确定（h中标注）。*P < 0.05。d、g、j中展示的是每组三个独立样本的代表性图像。

精准递送——无需配体修饰，实现T细胞优先转染

为了精确识别被转染的免疫细胞类型，研究人员使用mTmG双荧光报告基因小鼠模型，静脉注射了负载Cre重组酶mRNA的ERTLNPs（图2a）。结果显示，在脾脏免疫细胞中，T细胞的转染效率最高（8.04%），显著高于NK细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞（图2b-c）。在T细胞亚群中，CD8+ T细胞优先被转染。约5%的外周血T细胞也呈GFP阳性（图2d）。体外实验同样证实，ERTLNPs能高效转染近90%的Jurkat细胞、约20%的原代小鼠脾T细胞以及高达50%的人外周血单核细胞（图2e-g）。这些结果共同表明，无需任何靶向配体修饰，ERTLNPs即能实现体内外高效的T细胞优先转染。

图2：ERTLNPs在体外和体内均可实现高效mRNA递送至T细胞。a, 系统性给予负载Cre mRNA（记为mCre）的ERTLNPs后，在mTmG小鼠中介导转染的示意图。b,c, mTmG小鼠静脉注射PBS、ERTLNPs/mNC或ERTLNPs/mCre（1 mg/kg mCre）48小时后，脾脏细胞中GFP+细胞的代表性流式分析(b)及定量(c)。d, mTmG小鼠静脉注射ERTLNPs/mCre（1 mg/kg mCre）48小时后，外周血中CD45+CD3+细胞中GFP+细胞的定量。e, 经ERTLNPs/mGFP处理24小时后，Jurkat细胞中GFP+细胞的代表性流式图及定量。f, 经ERTLNPs/mGFP处理24小时后，原代小鼠脾脏T细胞中GFP+细胞的代表性流式图及定量。g, 经ERTLNPs/mGFP处理24小时后，人PBMCs中GFP+细胞的代表性流式图及定量。数据以均值±标准差表示，n=3个生物学独立样本。P值通过非配对双尾学生t检验（c、f）或单因素方差分析（ANOVA）及Dunnett多重比较检验（d、e、g）确定。*P < 0.001，**P < 0.0001。b、e-g中展示的是每组三个独立样本的代表性图像。

内在激活——快速驱动T细胞增殖，抑制耗竭表型

研究进一步发现，ERTLNPs具备内在的T细胞激活能力。体外培养中，经ERTLNPs处理的初始T细胞在24小时内即出现明显的聚集和增殖（图3a）。流式细胞术分析表明，ERTLNPs能显著上调T细胞早期激活标志物CD69的表达，其激活效率与经典的抗CD3/CD28抗体刺激相当，且动力学更迅速（6小时内即可检测到）（图3b-c）。更重要的是，与抗CD3/CD28刺激相比，ERTLNPs诱导的T细胞表达更低的耗竭标志物PD-1和TIM-3，同时记忆相关标志物CD44表达更高（图3e-g），提示其诱导的T细胞功能状态更优。细胞增殖实验也显示，ERTLNPs处理的T细胞在96小时后的增殖能力和Ki-67表达水平显著高于抗体刺激组（图3d）。机制上，研究证实ERTLNPs主要通过巨胞饮途径进入T细胞，并依赖溶酶体酸化过程。使用多种信号通路抑制剂筛选后发现，mTOR信号通路是ERTLNPs介导T细胞激活的关键（图3h-n）。

图3：ERTLNPs通过mTOR信号通路体外激活原代T细胞。a, 原代T细胞与PBS或ERTLNPs孵育24小时后的代表性明场图像。比例尺，50 µm。b, 与PBS、抗CD3/CD28、MC3 LNP、SM102 LNP、ALC0315 LNP或ERTLNPs孵育24小时后，CD8+ T细胞中CD69+细胞的定量。c, 与抗CD3/CD28或ERTLNPs孵育不同时间后，CD8+ T细胞中CD69+细胞的定量。d, CFSE标记的原代T细胞与抗CD3/CD28或ERTLNPs孵育0、48和96小时后的代表性流式图（左）及分裂指数定量（右）。e, 原代T细胞与PBS、抗CD3/CD28或ERTLNPs孵育72小时后，PD-1+TIM-3+细胞的代表性流式图及定量。f, 与抗CD3/CD28或ERTLNPs孵育不同时间后，T细胞培养上清中IL-2的浓度。g, 与PBS、抗CD3/CD28或ERTLNPs孵育48小时后，CD8+ T细胞中CD44+CD62L-细胞百分比（左）及CD44+CD62L+细胞百分比（右）。h, 原代T细胞与ERTLNPs在37°C或4°C下孵育的流式分析示意图。i, 原代T细胞分别与ERTLNPs在37°C或4°C下孵育后，CD3+CD8+ T细胞中CD69+细胞的定量。j, ERTLNPs介导T细胞激活的信号通路筛选示意图。CsA，环孢素A；FK506，他克莫司；RaPa，雷帕霉素；Torin1，TOR激酶抑制剂1。k-m, 初始T细胞经mTOR抑制剂预处理后，ERTLNPs介导的CD69表达(k)、T细胞增殖(l)及mRNA转染(m)的定量。n, ERTLNPs介导的初始T细胞激活效率与转染效率的相关性分析。数据以均值±标准差表示，n=3个生物学独立样本（b-g, l, k-n）。P值通过单因素方差分析及Dunnett多重比较检验（b, d, g, l, k, l, m）或双因素方差分析及Tukey多重比较检验（e, f）确定。 > 0.05，P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001。a中展示的是每组三个独立样本的代表性图像。h和j中的示意图使用BioRender创建。

机制解析——IGF-1R与TM4SF5双通路汇交于mTOR信号中枢

为了深入解析激活机制，研究人员发现ERTLNPs主要通过两种途径激活mTOR信号。一方面，ERTLNPs结合T细胞表面的胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）（图4j-r），使用特异性抑制剂AXL1717阻断IGF-1R后，ERTLNPs诱导的CD69和CD107a表达、细胞因子分泌以及PI3K/AKT/mTOR/S6的磷酸化水平均显著降低（图4g-i）。另一方面，被细胞内吞的ERTLNPs进入溶酶体后，其表面的精氨酸残基可被溶酶体膜蛋白TM4SF5感知，同样激活mTOR/S6通路，而使用TM4SF5竞争性抑制剂TsAHC可阻断此效应（图4d）。值得注意的是，在4°C低温下，虽然细胞摄取几乎完全被抑制，但ERTLNPs仍能诱导可检测的T细胞激活（图4e-f），进一步支持了细胞表面受体IGF-1R介导的激活途径的存在。因此，ERTLNPs通过细胞表面IGF-1R识别和细胞内溶酶体TM4SF5感知这两条并行的路径，共同汇交于mTOR信号中枢，实现高效的T细胞激活。

图4：ERTLNPs通过IGF-1R和TM4SF5介导的信号通路激活T细胞。a, 负载Cy5-mRNA的ERTLNPs与原代T细胞在37°C下孵育不同时间后的共聚焦显微镜图像。比例尺，5 µm。b, 初始T细胞经EIPA预处理后，CD8+ T细胞中CD69+细胞的定量。c, 初始T细胞经不同内吞途径抑制剂预处理后，对负载Cy5-mRNA的ERTLNPs的摄取效率。Cpz，氯丙嗪；MβCD，甲基-β-环糊精；EIPA，5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利。d, 初始T细胞经TM4SF5抑制剂TsAHC预处理后，CD8+ T细胞中CD69+（左）及pS6+（右）细胞的定量。e, ERTLNPs介导的mRNA摄取和T细胞激活在37°C和4°C下的比较示意图。f, ERTLNPs在37°C和4°C下介导的mRNA摄取（左）及CD8+ T细胞中CD69+细胞（右）的定量。g,h, 初始T细胞经各种受体抑制剂或阻断抗体预处理后，CD8+ T细胞中CD69+（g）和CD107a+（h）细胞的定量。i, 初始T细胞经AXL1717预处理后，与ERTLNPs孵育，培养上清中TNF-α（左）、IFN-γ（中）和IL-2（右）的浓度。j-q, 初始T细胞经AXL1717预处理后，再与ERTLNPs孵育不同时间，检测pPI3K+（j,k）、pAKT+（l,m）、pmTOR+（n,o）和pS6+（p,q）细胞的代表性流式图（j,l,n,p）及定量（k,m,o,q）。r, 初始T细胞与IGF-1孵育不同时间后，pPI3K+（左）、pAKT+（中）和pS6+（右）细胞的定量。数据以均值±标准差表示，n=3个生物学独立样本。P值通过单因素方差分析及Dunnett多重比较检验（b-d, f, g, h, k, m, o, q）或双因素方差分析及Tukey多重比较检验（i, r）确定。 > 0.05，P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001。e中的示意图使用BioRender创建。

功能验证——原位生成FAP CAR-T，特异性杀伤靶细胞

在验证了递送和激活效率后，研究团队设计了编码抗小鼠FAP CAR的mRNA（mFC），用于在体内外生成FAP CAR-T细胞（图5a-b）。体外实验显示，约25%的原代CD3+ T细胞在转染后24小时表达FAP CAR（图5c）。静脉注射ERTLNPs/mFC至小鼠体内后，约8%的脾脏T细胞成为CAR阳性，而其他免疫细胞类型的转染率均低于2%（图5d-f）。由于是非整合型mRNA，CAR表达呈瞬时性，在4天内从7.7%下降至3.9%（图5g-h），这种“脉冲式”表达特性有利于控制安全性。功能验证实验表明，ERTLNPs生成的FAP CAR-T细胞能特异性、剂量依赖性地杀伤FAP阳性的293T靶细胞，并分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子（图5i-k），其杀伤效力可与慢病毒载体生成的CAR-T细胞相媲美。

图5：ERTLNPs在体外和体内均可高效介导FAP CAR-T细胞的生成。a, ERTLNPs/mFC转染的T细胞向活化成纤维细胞迁移的示意图。b, FAP CAR分子组成示意图。c, 体外ERTLNPs/mFC转染24小时后，CD3+ T细胞中FAP CAR+细胞的百分比。d, ERTLNPs介导体内mRNA递送以产生FAP CAR-T细胞的示意图。e,f, C57小鼠静脉注射ERTLNPs/mFC（1 mg/kg mFC）24小时后，脾脏CD3+ T细胞中FAP CAR+细胞的代表性流式分析(e)及定量(f)。g,h, C57小鼠系统性给予PBS、ERTLNPs/mNC（非功能性mRNA）或ERTLNPs/mFC后第1-5天，脾脏CD3+ T细胞中FAP CAR+细胞的代表性流式分析(g)及定量(h)。i, 体外生成FAP CAR-T细胞和FAP+细胞，以及FAP CAR-T细胞对FAP+细胞细胞毒性的示意图。j, 在不同效靶比下，FAP CAR-T细胞对293T-FAP细胞的体外特异性杀伤百分比（以共培养24小时后GFP+靶细胞中PI+细胞百分比表示）。k, T细胞与293T细胞共培养后，细胞上清中TNF-α、IL-2和IFN-γ的浓度。数据以均值±标准差表示，n=3个生物学独立样本（c, f, h, j），n=5个生物学独立样本（k）。P值通过双尾学生t检验（c和f）确定。****P < 0.0001。e和g中展示的是每组三个独立样本的代表性图像。a和d中的示意图使用BioRender创建。

疾病模型——清除病理成纤维细胞，逆转纤维化并抑制肿瘤

在肺纤维化模型中，研究人员发现特发性肺纤维化患者样本中FAP表达显著升高（图6a）。在博来霉素诱导的小鼠模型中，ERTLNPs/mFC治疗组能有效减轻体重下降、降低肺湿重和羟脯氨酸含量（反映胶原沉积），效果与临床药物吡非尼酮相当（图6d-g）。免疫荧光染色显示，治疗组肺组织中FAP阳性成纤维细胞和促纤维化的巨噬细胞浸润显著减少（图6h-i），肺泡结构得到修复，同时促纤维化因子TGF-β1、IL-4、IL-13和bFGF水平也显著下降（图6l-o）。在肝纤维化模型中，ERTLNPs/mFC治疗同样有效降低了肝重、羟脯氨酸含量和胶原沉积，并改善了肝功能指标。在胰腺癌模型中，ERTLNPs/mFC治疗显著抑制了肿瘤生长，增加了肿瘤内CD8+ T细胞浸润，并降低了肿瘤相关成纤维细胞和髓系来源的抑制细胞，重塑了肿瘤微环境。安全性评估显示，ERTLNPs治疗未引起显著的细胞因子释放综合征或补体激活，对主要器官无明显毒性，且在本次研究采用的重复给药方案下未诱导T细胞耗竭，优于传统的抗CD3抗体或SM102 LNP等对照。

图6：ERTLNPs介导的体内FAP CAR-T细胞生成有效缓解肺纤维化。a, 利用公开GEO RNA-seq数据集GSE213001分析的IPF患者纤维化肺组织（n=60）和正常肺组织（n=40）中FAP的表达。数据以箱线图表示，中心线为中位数，箱体边界为第25和75百分位数，须线为最小和最大值。b, 健康小鼠和博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织代表性免疫荧光图像，显示细胞核、FAP+细胞和FAP CAR-T细胞（如图例所示）。白色箭头表示FAP CAR-T细胞与FAP+细胞之间的接触。比例尺，10 µm。c, TGF-β1（10 ng/ml）处理24或48小时后，原代小鼠肺成纤维细胞中FAP、α-SMA和波形蛋白表达的代表性荧光图像。d, ERTLNPs/mFC在博来霉素诱导的肺纤维化模型中的治疗方案示意图。e, 博来霉素给药后21天内，接受不同治疗的肺纤维化C57小鼠的平均体重变化。f,g, 治疗后肺纤维化C57小鼠的肺湿重(f)和羟脯氨酸水平(g)。吡非尼酮（25 mg/kg，隔日口服灌胃）作为阳性对照。h,i, 治疗后肺纤维化C57小鼠肺组织中FAP+细胞(h)和F4/80+细胞(i)的代表性免疫荧光图像。使用年龄和体重匹配的健康小鼠作为对照。j,k, 治疗后肺纤维化C57小鼠肺组织代表性H&E (j) 和Masson三色 (k) 染色图像。使用年龄和体重匹配的健康小鼠作为对照。l-o, 治疗后肺纤维化C57小鼠肺组织中TGF-β1 (l)、IL-4 (m)、IL-13 (n) 和bFGF (o) 的细胞因子水平。使用年龄和体重匹配的健康小鼠作为对照。数据以均值±标准差表示，n=5个生物学独立样本（e-o）。P值通过双尾非配对学生t检验（a）或单因素方差分析及Dunnett多重比较检验（f, g, l-o）确定。 > 0.05，P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.0001。c中展示的是每组三个独立样本的代表性图像。h-k中展示的是每组五个独立样本的代表性图像。d中的示意图使用BioRender创建。

前景与转化——“现成型”策略拓展CAR-T疗法应用边界

综上所述，这项研究成功开发了一种名为ERTLNPs的“现成”型T细胞激活mRNA递送系统，它巧妙地避开了复杂的抗体修饰和外周血T细胞的体外操作，通过激活两条互补的信号通路，在体内实现了高效且安全的CAR-T细胞生成。该系统在多种纤维化疾病和实体瘤模型中展现了卓越的治疗潜力，并具有良好的生物安全性。这一“自激活”策略为T细胞工程化提供了全新的范式，极大地拓展了CAR-T细胞疗法的应用前景。虽然FAP并非完全疾病限制性靶点，但ERTLNPs介导的瞬时CAR表达特性为其安全性提供了天然屏障。未来，研究团队计划与临床医生合作，探索更多疾病特异性的靶点，并推动该技术的临床转化，使其成为治疗多种难治性疾病的有力武器。