浙江
近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所何康敏研究员团队与中国科学院生物物理研究所蔡华清研究员团队合作完成了题为《Lipid turnover and GEF recruitment collectively determine Rab5 recruitment and activation during the first step of early endosome formation》的研究论文。该研究综合利用基因编辑、单分子活细胞成像和体外脂体重构等技术，系统回答了Rab5蛋白在早期内体形成过程中被精确招募至新生内吞囊泡的分子机制。
细胞内吞囊泡脱离质膜后需要经历一系列复杂变化才能成熟为具有分拣功能的早期内体，而小GTP酶Rab5的膜定位与激活是这个过程中最为关键的起始步骤。尽管Rab5在细胞内吞通路中的核心地位已经被广泛认可，科学界一直未能解释一个根本性的问题：Rab5如何在合适的时间和地点被精确激活，同时避免在质膜或其他细胞器上发生错误定位。
研究团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对内源Rab5及其两个鸟嘌呤核苷酸交换因子Rabex5和hRME6分别进行了荧光蛋白标记，随后在活细胞中以单分子灵敏度的TIRF显微镜观察这些蛋白质在内吞事件全过程中的动态行为。他们发现Rabex5和hRME6虽然都具备激活Rab5的催化能力，两种GEF分子的招募模式却呈现出鲜明的差异。Rabex5在囊泡脱去网格蛋白外壳之后持续结合在新生囊泡的表面，而hRME6仅在脱壳发生的一瞬间出现一次短暂的爆发式招募，随后便迅速从囊泡上解离。通过分别构建单基因敲除和双基因敲除的细胞系，研究团队证实只有同时缺失Rabex5和hRME6才能完全消除Rab5向新生内吞囊泡的招募以及Rab5阳性早期内体的形成，单独敲除其中任何一种GEF均不足以彻底阻断这一过程。
在确认两种GEF协同发挥功能的基础上，研究团队进一步探索了Rab5膜定位特异性的调控机制。他们将Rabex5或其具有催化活性的Vps9结构域人为引导至质膜或网格蛋白包被凹陷，发现Rab5依然无法结合到这些错误定位的膜结构上。研究团队据此推测质膜上可能存在某种抑制Rab5膜结合的负调控因子。通过一系列体外脂质体结合实验和活细胞内的光遗传学操作，他们锁定了一种在质膜内叶高度富集的磷脂分子——磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）。体外浮选实验的结果显示含有PI(4,5)P2的脂质体即便结合了有活性的Vps9结构域也无法有效结合Rab5，而移除PI(4,5)P2后Rab5与脂质体的结合能力得到了显著恢复。在活细胞中利用光遗传学手段急性水解质膜上的PI(4,5)P2后，被错误引导至质膜的Vps9结构域成功将Rab5募集到了质膜上。这些结果将PI(4,5)P2定义为一道防止Rab5过早或错误结合质膜的分子屏障，其功能是在空间上保障Rab5仅能在PIP2已被水解的新生囊泡表面被GEF激活。
该研究的生理病理意义在Lowe综合征的细胞模型中得到了验证。Lowe综合征是由OCRL基因突变导致的罕见遗传病，OCRL编码的肌醇五磷酸酶负责水解PI(4,5)P2。研究团队在Lowe综合征患者成纤维细胞中观察到早期内体的数量出现了显著下降，表明PI(4,5)P2的水解障碍直接干扰了Rab5的正常招募并削弱了早期内体的生物发生效率。这项研究提出的“GEF招募与脂质转换协同作用”的双重调控模型，为理解早期内体形成的时空精确性提供了新的分子框架，也为Lowe综合征等内吞相关疾病的病理机制提供了全新的解释视角。
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