北京
图 1：视野显示线性 DNA 延伸，用于实时研究 DNA 复制。DNA 基质的一端通过链霉亲和素-生物素相互作用附着在玻璃盖玻片上，因此当施加流动时，DNA 分子伸展，而其他分子伸展通过相同的相互作用末端附着到表面。这些线性 DNA 片段被用作复制测定的基础。一端模仿预引发的复制叉，复制机器可以在其中组装。为了实时观察复制，聚合酶是用单一染料标记，而 DNA 本身用不同颜色标记。图像仅显示 DNA 通道。聚合酶可以与 DNA 相关联，并且可以估计复制率。由于聚合酶上的染料单一，需要一个高灵敏度的相机在实验过程中对它们进行成像而不漂白。
背景
Duderstadt 小组对了解大分子复合物的组织和动力学感兴趣，例如负责 DNA 复制的复制体。
成功的 DNA 复制对于细胞生存至关重要，而这一过程中的错误与许多疾病病理有关。 Duderstadt 小组通过将荧光标记酶(例如 DNA 聚合酶和 RNA 聚合酶)引入细菌模型系统来研究这一过程。这使得他们能够在复制过程中沿着 DNA 底物移动时可视化并跟踪复制体内的聚合酶。然后，他们可以使用 kymograph 分析来量化 DNA 链上的运动，以更好地了解这些过程。
该小组在研究中主要使用自制的单分子微镜 TIRF 成像系统。微镜无需二向色镜，可以快速切换颜色，也无需滤光轮，使其成为实时成像的理想系统。
挑战
杜德斯塔特教授告诉我们，“我们最大的挑战是收集多少光子以及我们正在观察的荧光团的相应寿命。这有时限制了我们的追踪能力。”因此，该小组需要最高的相机灵敏度，以确保染料不会漂白，并允许收集尽可能多的光线以进行跟踪。
更快的帧速率和更低的成本也是决定购买新相机的重要因素。 Duderstadt 教授告诉我们，“理想情况下，我们希望输入最少量的激发光，以便在一段时间内有足够的信号跟踪聚合酶。这就是为什么我们过去使用 EMCCD 相机，但在我们看来，Prime BSI 的灵敏度可以与 EMCCD 相媲美。
芯片尺寸很大，给我们带来了很大的视野，这真是太棒了，而且像素尺寸很小，只有 6.5 微米，这使得我们可以在 60 倍镜头上进行奈奎斯特匹配，从而最大限度地提高我们实验中的分辨率。——卡尔·杜德施塔特
解决方案
Duderstadt 小组现在在其定制单分子微镜 TIRF 系统上使用 Teledyne Photometrics Prime BSI。 Duderstadt 教授告诉我们，“我们比较了不同制造商的规格，但 Teledyne Photometrics Prime BSI 提供了我们所需的 QE、芯片规格和多 ROI 功能”。
他还告诉我们，“芯片尺寸很大，为我们提供了很大的视野，这真是太棒了，而且像素尺寸很小，只有 6.5 微米，这允许我们的 60X 镜头上进行奈奎斯特匹配，从而最大限度地提高我们实验中的分辨率。多 ROI 功能也将允许更高的帧速率，我们正在考虑进行一些实验来利用这一点。”
他接着说，“虽然迄今为止我们的大多数应用还没有达到极高的帧速率，但未来我们确实希望使用金纳米粒子来研究 DNA 分子的旋转，并且这些可能具有更快的动力学，这是选择 Prime BSI 的进一步动机。”
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