《食品科学》：江南大学何冬旭教授等：五没食子酰葡萄糖通过影响内皮型一氧化氮合酶磷酸化改善高血压小鼠内皮损伤的机制

高血压作为全球性的重大公共卫生挑战，是导致心、脑、肾等靶器官损害及心血管事件发生的主要危险因素。目前临床常用降压药物包括利尿剂、β-受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂等。尽管这些药物疗效明确，但由于其作用靶点通常具有全身性，常伴随一系列副作用。因此，开发特异性更强、副作用更小的新型降压策略显得尤为重要。

血管内皮功能障碍是高血压发生与演进的核心病理环节。在正常生理状态下，内皮细胞通过内皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化生成一氧化氮（NO）。NO是维持血管舒张功能与内皮稳态的关键信号分子。eNOS活性受其特定位点磷酸化的精密调控。其中，Ser1177位点的磷酸化是激活该酶、促进NO生成的关键机制。然而，在高血压状态下，多种致病因素会导致eNOS（Ser1177）磷酸化水平下降。这致使NO生物利用度降低，从而加剧血管功能障碍。

近年来，天然化合物因其来源广泛、多靶点作用及副作用较小等优势，在心血管疾病防治领域展现出广阔前景。已有研究报道，黄酮类、多酚类等天然成分具有改善内皮功能的潜力。槲皮素、白藜芦醇、芹菜素等植物化学物通过靶向血管重塑、炎症和氧化应激相关信号通路发挥抗高血压作用。然而，传统研究模式多依赖于大规模随机筛选，目标性不强且效率有限。为突破这一局限，本研究创新性地采用计算机辅助药物筛选与实验验证相结合的研究策略。

五没食子酰葡萄糖（PGG）作为一种天然多酚类化合物，在抗癌、抗氧化及心血管保护等方面表现出多种生物活性，然而其与eNOS的相互作用及在高血压中的功能研究鲜见系统报道。基于此，江南大学食品学院的杨加祥、何冬旭*和江南大学无锡医学院的刘源综合运用在体实验（高血压小鼠模型）、离体（人冠状动脉内皮细胞（HCAEC））实验及转录组测序与生物信息学分析，系统探讨PGG能否精准靶向并激活eNOS，进而改善高血压病理状态下内皮功能障碍的作用与机制，以期为将PGG开发为靶向eNOS的潜在高血压治疗药物奠定坚实的实验与理论基础。

1 靶向eNOS天然小分子的筛选及验证

按照1.3.1节方法，基于eNOS的三维结构，利用Discovery Studio对其16 个潜在结合位点进行分子对接分析，按评分排序筛选前10 个化合物。LibDock打分前10的天然化合物依次是PGG、瓜子金皂苷V、异麦角甾苷、瓜子金皂苷己、重楼皂苷D、重楼皂苷B、管花苷A、金石蚕苷、凤仙萜四醇苷K、赶黄草苷A。有研究表明，PGG存在于芍药等多酚类植物中，具有改善氧化应激、降血糖及预防心血管疾病等作用。瓜子金皂苷己是从远志科植物瓜子金（Polygala japonica）中提取的一种齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，具有显著的抗炎和神经保护作用。瓜子金皂苷V是从远志科植物瓜子金中分离出的一种三萜皂苷，具有抗炎、抗菌、抗抑郁等药理作用。异麦角甾苷是一种从植物中提取的化合物，具有抗炎特性。重楼皂苷D是从百合科植物多叶重楼中提取的一种甾体皂苷类化合物，已被证实具有显著的抗肿瘤活性。它通过多种机制发挥抗癌作用，包括诱导细胞凋亡、抑制血管生成、激活氧化磷酸途径等。重楼皂苷B是从重楼属植物中提取的一种甾体皂苷类化合物，具有显著的抗肿瘤活性，它通过多种机制发挥抗癌作用，包括诱导细胞凋亡、抑制血管生成、调节免疫反应等。管花苷A主要来源于列当科肉苁蓉属植物，初步研究显示其具有抗氧化活性，可能对神经细胞有保护潜力。凤仙萜四醇苷K属于苯丙素类化合物，它主要存在于凤仙花属植物中，有报道称其具有抗炎、抗氧化活性。金石蚕苷是从来江藤的茎和叶中分离出来的咖啡酰化的苯丙烷糖苷化合物，在脑缺血动物模型中表现出明确的神经保护作用。赶黄草苷A从非洲草药中提取，在保护神经和抗肿瘤方面显示双重潜力。其中，PGG对接分数最高（图2a、b），且与已知心血管相关文献报道最多，综合选定PGG进行后续验证。分子对接模拟显示PGG与eNOS结合良好（图2c、d）。

2 PGG作用于eNOS（Ser1177）浓度与作用时间

eNOS Ser1177位点（人类为Ser1177，小鼠为Ser1179）是eNOS最关键的正向调控磷酸化位点，被视为激活eNOS、产生NO的“主开关”或“油门”。为模拟血管内皮细胞对高盐引起的高血压（盐敏性高血压）环境的应激，以60 mmol/L NaCl处理HCAEC细胞48 h以构建高盐冠状动脉内皮细胞损伤模型（高盐HCAEC细胞）。结果显示，高盐处理使HCAEC细胞eNOS的Ser1177位点磷酸化水平显著降低（P＜0.001）（图3）。随后，以不同浓度、不同作用时间的PGG处理细胞，检测eNOS磷酸化的影响。

用不同浓度PGG（10、20、40 µmol/L）孵育HCAEC细胞24 h。定量分析表明，在非高盐条件下，20、40 µmol/L PGG能使eNOS磷酸化水平提升到对照组的（1.63±0.19）、（1.71±0.33）倍（P＜0.05）（图4a），在高盐条件下，10、20、40 µmol/L PGG处理分别使p-eNOS/eNOS比值上升到高盐对照组的（1.72±0.62）（P＜0.05）、（2.39±0.61）倍（P＜0.001）与（2.71±0.30）倍（P＜0.001）（图4b），说明PGG不仅具有“保护”作用，还具有“激活”作用。

在非高盐条件下，24 h和48 h PGG处理能使磷酸化水平显著提升到对照组的（1.66±0.73）倍（P＜0.05）与（1.96±0.44）倍（P＜0.01）（图4c）。在高盐条件下，使用20 µmol/L PGG处理HCAEC不同时间（12、24、48 h），使p-eNOS/eNOS比值分别上升到高盐对照组的（2.58±0.52）（P＜0.01）、（2.42±0.61）倍（P＜0.01）与（2.59±0.43）倍（P＜0.01）（图4d）。

综合浓度和时间实验，确定20 µmol/L PGG处理24 h为后续细胞机制研究的实验条件，此条件细胞在高盐与正常状态下均能显著提高eNOS Ser1177位点磷酸化水平。

3 PGG对NO含量的影响

NO含量（尤其生物活性NO）是确认eNOS功能激活的关键证据。使用一氧化氮测定试剂盒检测正常与高盐培养条件下，用20 µmol/L PGG处理24 h前后HCAEC细胞上清液内NO水平。

如图5所示，在高盐状态下，PGG能使细胞上清液NO水平由（74.9±6.81）µmol/L上升到（125.10±7.37）µmol/L （P＜0.001），在正常状态下，PGG能使细胞上清液NO水平由（150.10±8.74）µmol/L上升到（185.30±12.34）µmol/L（P＜0.05）。这表明PGG能显著提升正常、高盐孵育的HCAEC细胞中NO水平。这一检测结果与eNOS磷酸化数据关联分析，强化PGG能使eNOS激活（表现为Ser1177位点磷酸化程度加强），进而NO释放量增加。

4 PGG作用于eNOS（Thr495）磷酸化位点分析

eNOS Thr495位点（在人类中为Thr495，在小鼠中为Thr497）是eNOS的一个至关重要的负调控磷酸化位点。为探究PGG能否作用于eNOS（Thr495）磷酸化位点，按照1.3.6节方法，研究20 µmol/L PGG处理24 h对正常与高盐条件下HCAEC的eNOS（Thr495）磷酸化的影响。结果表明PGG不能使eNOS（Thr495）磷酸化水平发生显著改变，说明PGG主要作用于eNOS（Ser1177）磷酸化位点（图6）。

5 PGG对正常小鼠主动脉血管段的舒张功能的影响

细胞学实验结果表明，PGG能影响内皮细胞eNOS（Ser1177）磷酸化水平，进而影响eNOS活性。为了在组织水平上进行验证，取正常小鼠的主动脉血管段进行实验。NG-硝基-L-精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）为eNOS特异性抑制剂，实验分为3 组：溶剂对照组、PGG处理组（20 µmol/L PGG孵育30 min）、PGG+L-NAME组（20 µmol/L PGG+100 µmol/L L-NAME共孵育30 min），然后测定血管张力。结果显示，PGG处理组的血管舒张程度（（84.7±4.52）%）显著高于溶剂对照组（（74.90±4.36）%）（P＜0.05）。当加入eNOS抑制剂L-NAME后，血管舒张过程被显著抑制（（29.60±5.03）%，P＜0.001）（图7）。这说明，PGG改善主动脉内皮舒张功能的主要机制是激活eNOS。

6 PGG缓解小鼠高血压进程

由图8a、b可知，第14天，高盐饮食对照组小鼠血压升高，但是接受了PGG灌胃的小鼠血压呈现降低趋势；第35天，PGG灌胃组小鼠平均收缩压（（111.00±1.52）mmHg）、平均舒张压（（91.00±1.43）mmHg）显著低于高盐对照组（平均收缩压（124.00±1.62）mmHg、舒张压（103.00±1.48）mmHg，P＜0.001）。因此，结果提示PGG可以缓解小鼠高血压进程。通过对PGG灌胃组与高盐对照组小鼠分离主动脉原代内皮细胞，发现PGG灌胃组eNOS磷酸化显著上升（图8c），PGG灌胃组p-eNOS/eNOS比值为高盐对照组的（2.05±0.43）倍（P＜0.001），表明PGG对eNOS具有较好激活作用。

离体微血管张力实验可通过测定小鼠的血管内皮依赖性舒张，揭示血管内皮受损与功能性障碍。与高盐对照组相比，灌胃后的疾病小鼠主动脉内皮依赖性舒张程度由（47.82±5.51）%升至（64.33±4.62）%（P＜0.05）（图8d）。结果提示，PGG有效缓解了高血压小鼠的主动脉舒张障碍。

7 PGG改善高血压小鼠主动脉段内皮损伤的机制探究

为深入解析主动脉内皮细胞和PGG互作过程中涉及的与eNOS激活相关的通路，将高血压对照组小鼠与PGG灌胃组的主动脉血管段基于Illumina/MGI测序平台进行转录组双端测序（n＝3），使用链特异性建库。对测序结果进行质控与过滤，使用FastQC评估原始数据质量，Cutadapt过滤低质量序列。6 个样品的转录组分析共获得17.11 Gb的CleanData，各样品CleanData均达到2.54 Gb以上，Q30碱基百分比在96.62%以上，GC含量稳定，数据质量高。对测序结果CleanData进行后续生物信息学分析。

将高盐对照组与PGG灌胃组主动脉血管段的CleanData使用DESeq2软件进行组间差异基因分析，获得两组间发生差异表达的基因（|log2差异倍数|＞1、P＜0.05），共发现200 个差异基因，其中154 个显著上调基因，46 个显著下调基因（图9a），基因热图如图9b所示。

对这些基因进行基因本体论（GO）（图9c）与差异基因表征的显著性水平P值（图9d）分析。在生物过程方面，差异基因在B细胞受体信号通路、先天免疫应答、补体激活（经典途径）和乙酰辅酶A代谢过程等过程方面显著富集。在细胞组分方面，差异基因在质膜和质膜外侧等部位显著富集。在分子功能方面，差异基因显著富集于抗原结合、免疫球蛋白受体结合和苹果酸脱氢酶（脱羧，NAD+）活性（NAD+依赖性苹果酸酶）等功能。

同时，对差异基因进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，发现在KEGG代谢过程中，丙酮酸代谢、丙酸代谢、脂肪酸代谢、脂肪酸生物合成、皮质醇合成与分泌、钙信号通道等过程都显著富集（图9e、f）。总之，上述差异基因功能富集结果可作为PGG改善eNOS磷酸化潜在机制探索的重要切入点。

8 PGG靶向对NAD+/NADH活性的影响

转录组学是发现性工具，为机制研究提供了线索和方向（如指向能量代谢），但具体的因果链条需要后续靶向实验验证。通过对上述差异基因功能富集结果提示（如KEGG富集到的丙酮酸代谢、脂肪酸代谢等，GO富集到的苹果酸脱氢酶（脱羧）（NAD + ）活性代谢过程），PGG灌胃后，相当部分能量代谢相关通路被激活，于是后续重点关注与eNOS磷酸化相关的能量代谢通路。β-拉杷醌可通过激活NQO1提升NAD + /NADH比值，进而促进eNOS Ser1177磷酸化，提高NO的释放，使血管舒张并降低血压。其中NAD + 是细胞代谢的中心枢纽和关键调节因子，其水平直接决定细胞的能量产出效率、代谢适应性和整体健康状态。

因此，研究PGG是否通过类似机制发挥作用，检测20 µmol/L PGG孵育24 h对正常HCAEC以及高盐HCAEC NAD + /NADH比值的影响。结果显示，正常细胞中，PGG处理组NAD + /NADH比值（11.51±1.40）显著高于对照组（8.50±0.80）（P＜0.05）；高盐细胞中，PGG处理组比值（5.35±0.33）亦显著高于高盐对照组（2.67±0.32）（P＜0.001）（图10）。因此，结果提示PGG可以显著提升内皮细胞NAD + /NADH比值，并激活下游通路。

9 PGG对Nampt含量的影响

Nampt是哺乳动物体内NAD + 生物合成补救途径中的限速酶和关键调控因子，直接决定了细胞内NAD + 的水平。为了进一步探究PGG→NAD + /NADH的上游机制，通过Nampt ELISA试剂盒检测正常与高盐培养条件下HCAEC细胞用20 µmol/L PGG处理24 h后细胞上清液中Nampt水平。如图11所示，在高盐状态下，PGG能使细胞上清液Nampt水平由（7.35±0.39）µg/mL 上升到（12.56±0.71）µg/mL（P＜0.001），在正常状态下，PGG能使细胞上清液Nampt水平由（14.97±0.88）µg/mL上升到（18.87±1.79）µg/mL （P＜0.05）。这表明PGG能显著提升正常、高盐孵育的HCAEC细胞中Nampt水平。这一检测结果与PGG调控NAD + /NADH比值上升关联分析，建立内皮功能的一个潜在核心机制“PGG→Nampt提升→NAD + /NADH比值增加→p-eNOS Ser1177位点磷酸化→NO合成→血管舒张功能改善与血压降低”的逻辑链条，为NAD + /NADH上游机制验证提供支持。这也为理解天然多酚如何通过调节细胞代谢稳态发挥心血管保护作用提供了新的实验框架和分子线索。

10 讨论与结论

本研究揭示，天然小分子化合物PGG可通过提升eNOS Ser1177位点的磷酸化水平，进而激活eNOS、促进NO生成，最终改善高血压小鼠血管内皮依赖性舒张功能并降低血压。其潜在机制可能为：PGG上调细胞内Nampt表达，提高NAD+/NADH水平，从而靶向增强eNOS（Ser1177）磷酸化，即遵循“PGG→Nampt提升→NAD+/NADH比值增加→p-eNOS Ser1177位点磷酸化→NO合成→血管舒张功能改善与血压降低”的逻辑链条。该发现为高血压及相关血管内皮损伤的治疗提供了新的思路与潜在药物靶点。

尽管槲皮素、白藜芦醇与EGCG等经典植物多酚可通过磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/ 蛋白激酶B（Akt）通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路或沉默信息调节因子1通路等不同通路激活eNOS，且PGG同样富含酚羟基结构，可能具有类似作用机制，但本研究提示其通过NAD+/NADH代谢调控eNOS激活可能为一新特征。然而，该通路的具体环节尚需进一步验证与完善，未来研究可从以下几方面深入：

1）作用靶点与直接互作验证：利用表面等离子共振或等温滴定量热法等技术，直接检测PGG是否与eNOS蛋白发生物理结合，从而明确其是否为直接作用靶点，深入阐明药物-蛋白互作机制。

2）上下游信号通路的系统解析：需进一步考察PGG对eNOS上游关键激酶（如Akt与AMPK）磷酸化状态的影响。若变化不显著，则应探索其是否通过影响eNOS与其他调控蛋白的相互作用或修饰状态（如乙酰化）发挥作用。同时，对NAD+合成途径中的其他关键组分，如烟酰胺单核苷酸及其腺苷酰转移酶，以及使用特异性抑制剂进行通路阻断实验，将有助于完整描绘该调控网络。

3）转化应用与安全性评价：目前有力证据多源于细胞与动物实验，所用剂量远高于日常膳食摄入。未来需开展大规模、长期的人体临床试验，以明确其作为膳食补充剂的有效剂量与形式。此外，PGG的口服生物利用度、体内代谢途径及高剂量长期使用的安全性尚待系统评估，可借鉴槲皮素、白藜芦醇等同类物的发展经验（如制剂优化、与增效剂联用），以提升其应用可行性。

综上，本研究初步揭示了PGG通过Nampt-NAD+/NADH轴激活eNOS、改善血管功能的新机制，为心血管保护提供了新的候选分子。后续需围绕靶点验证、通路细化及转化研究开展深入工作，以推动其向临床应用的转化。

作者简介

通信作者：

何冬旭，博士，江南大学食品学院教授，博士生导师，江苏省“六大人才高峰”计划入选者。2007年7月获山东大学生命科学学士学位，2011年12月获香港中文大学生物医学博士学位。2012年1月起任江南大学生物工程学院副教授，2017年5月晋升为教授，2018年1月转任食品学院教授。现任国际期刊《Cancer Studies》副主编，兼任《FEBS Journal》《OncoTargets and Therapy》等期刊审稿人。

主要从事食品营养与健康研究，聚焦食药同源食物对心血管健康、机体稳态的分子机制，探索肠道菌群调控免疫炎症疾病的干预策略。结合医学生物学、微生物学、食品科学等学科领域的理论与技术，开展微环境与信号通路、营养-生理与遗传-健康方面的研究工作，尤其在食药同源的食物影响哺乳动物细胞增殖、心血管健康和机体稳态的分子机制研究方面取得了一定成绩。主持国家自然科学基金青年、面上、应急项目及省部级课题，阐明大豆皂甙调节肠道菌群改善高血压的机制，揭示蒙花苷靶向内凝集蛋白1改善糖尿病血管内皮功能障碍的作用。在《EMBO Molecular Medicine》《PNAS》等期刊发表SCI论文19 篇，获中国发明专利3 项。研究成果获江苏省科学技术奖三等奖、江苏省药理科学技术奖一等奖。

第一作者：

杨加祥，江南大学食品学院2023级食品工程专业硕士研究生，研究方向为食药同源食物对心血管健康及机体稳态的分子机制。2019年7月毕业于合肥工业大学食品科学与工程专业，获工学学士学位。本科期间获评“合肥工业大学优秀学生干部”，研究生阶段荣获江南大学研究生二等奖学金。

引文格式：

杨加祥, 刘源, 何冬旭. 五没食子酰葡萄糖通过影响内皮型一氧化氮合酶磷酸化改善高血压小鼠内皮损伤的机制[J]. 食品科学, 2026, 47(9): 179-189. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251126-201.

YANG Jiaxiang, LIU Yuan, HE Dongxu. 1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-β-D-glucose ameliorates endothelial injury in hypertensive mice by affecting eNOS phosphorylation: a mechanistic study[J]. Food Science, 2026, 47(9): 179-189. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251126-201.

实习编辑：普怡然；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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