3D打印仿生水凝胶海绵体！华南理工大学Biomaterials：修复猪勃起功能障碍

阴茎损伤常导致海绵体结构的迅速破坏，最终引发勃起功能障碍（ED）。由于受损组织自身的再生能力极为有限，现有药物仅能短暂改善血流动力学，无法逆转器质性结构损伤；而传统手术修复又受限于海绵体复杂的血管网络，难以实现精准重建。因此，如何同时实现结构修复与功能再生，已成为治疗阴茎损伤后ED的关键临床难题。三维打印技术在构建具有复杂循环系统的动态器官模型方面展现出独特优势，但此前尚未有成功开发出模拟海绵窦等复杂结构的仿生海绵体。此外，生物材料植入体内后可能引发免疫排斥，尤其是T细胞介导的排斥反应和过度炎症，严重制约了修复效果的长期稳定性。间充质干细胞（MSCs）因具有低免疫原性、可分泌大量生物活性物质以及与生物支架良好兼容等特点，被视为ED治疗的潜在突破口，但其具体分子机制尚不明确。

针对上述挑战，华南理工大学施雪涛教授、王迎军院士与迟安妮研究员联合团队设计并利用DLP 3D打印技术制备了一种水凝胶基仿生海绵体支架，该支架具有海绵窦样结构，并在体外流体灌注下可模拟阴茎勃起过程。将猪脐带来源的间充质干细胞接种于肝素涂层的水凝胶支架上，植入猪海绵体缺损模型中。治疗8周后，MSCs功能化支架不仅促进了水凝胶降解和组织整合，还实现了损伤海绵窦的近乎完全结构再生，并在电刺激神经诱导下恢复至正常勃起形态（持续约60秒）。在生育力实验中，MSCs+植入组的4头雌性猪共产下17头仔猪，接近正常组的19头，而单纯缺损组仅1头雌猪产下4头仔猪。单细胞RNA测序揭示，MSCs通过促进内皮细胞终末分化、减少CD4+ T细胞分泌TGF-β以抑制内皮-间质转化（EndMT），并激活M1巨噬细胞的抗炎IL-10信号、下调M2巨噬细胞的促炎通路，从而抑制过度炎症并减轻移植排斥。该研究不仅深化了对MSCs治疗阴茎损伤后ED的机制理解，也为男性生殖功能重建提供了高效的临床前治疗策略。相关内容以 Development and mechanistic investigation of 3D-printed biomimetic corpus cavernosum seeded with MSCs for restoring erectile function in pigs为题，发表在 Biomaterials上！

研究团队首先根据海绵体微血管网络与勃起功能的关系，设计并标准化了仿生海绵体模型的主要结构（图1b），利用明胶、丙烯酸、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）、光引发剂LAP及酒石黄组成的打印墨水，通过405 nm光照引发自由基聚合，形成共价交联的互穿聚合物网络（图1c）。微CT和三维重建显示，模型整体及内部微血管网络具有高打印精度。随后，团队对模型进行体外灌注，以生理勃起血流速率（90 mL/min）注入含红细胞（血细胞比容40%）的PBS悬液，观察到高速液流使海绵窦扩张变形，窦间距显著缩小，模拟了勃起状态（图1d）。进一步使用红色Microfil血管造影剂灌注后，从前视图（图1e-f）、纵切面（图1g）和横切面（图1h）均可清晰看到模型包含海绵体动脉、海绵窦、窦后静脉及静脉丛，证实了3D打印仿生海绵体在结构上对天然组织的精确复制。

图1. 3D打印水凝胶基仿生海绵体的表征。 a，阴茎解剖结构示意图。海绵窦与小动脉相连，小动脉再与海绵体动脉相连。 b，仿生海绵体模型的结构设计。上层海绵窦中的窦后静脉穿过下层两个海绵窦之间的空隙。 c，仿生阴茎海绵体3D打印的光聚合打印及墨水组成示意图。 d，仿生海绵体模型在灌注初期和勃起状态下的照片，显示勃起过程中模型尺寸增大。 e，仿生阴茎模型的正视图。模型灌注了红色Microfil。 f，仿生海绵体局部放大正视图。 g，仿生阴茎海绵体模型纵切面示意图。 h，仿生阴茎海绵体横切面示意图。

在体内实验中，团队将携带mCherry荧光标记的猪脐带MSCs接种于仿生海绵体支架上，体外共培养7天，细胞在材料表面达到融合并组织成类窦样结构（图2b-c）。将MSCs+支架植入猪海绵体缺损后（图2a），8周后活体成像仍可检测到mCherry信号，而单纯植入组无信号，表明MSCs在体内长期存活（图2d）。组织切片染色显示，MSCs+植入组中水凝胶完全降解，海绵窦结构与正常组几乎无差异；而单纯植入组残留未降解水凝胶，窦结构发育不良；缺损组则海绵窦几乎不可辨认，且出现严重纤维化（图2f）。免疫荧光可见mCherry+细胞围绕海绵窦内皮细胞分布（图2e）。在功能恢复上，术后2周电刺激神经诱发的勃起实验中，MSCs+植入组勃起形态正常且可维持约60秒，而缺损组勃起角度小于180°。最终，MSCs+植入组雄猪与雌猪合笼后（图2g），4个月内共产下17头仔猪（图2h-i），接近正常组的19头，而缺损组和单纯植入组分别仅产下4头和9头仔猪，证实了修复后的阴茎可正常完成勃起与射精，生殖功能得以恢复。

图2. 接种MSCs的3D打印水凝胶基仿生模型在猪体内修复损伤海绵体的功能重建。 a，将接种MSCs的仿生海绵体植入猪损伤海绵体的手术流程示意图。 b，仿生海绵体中MSCsmCherry的3D免疫荧光图像。CD44（紫色）和CD29（绿色）为经典MSC标志物。比例尺：100 μm。 c，MSCsmCherry接种于仿生海绵体并体外共培养7天。比例尺：200 μm。 d，植入后猪体内MSCsmCherry的活体成像。实验独立重复3次。色标表示辐射效率。 e，海绵体切片中CD31（黄色）和mCherry+细胞（红色）的荧光成像。实验独立重复3次。比例尺：100 μm。 f，正常组、缺损组、植入组和MSCs+植入组海绵体横切面的H&E和Masson三色染色图像。实验独立重复3次。比例尺：100 μm。 g，交配实验步骤时间线。 h，MSCs+植入组中雌猪和新生仔猪的代表性图像。 i，各组怀孕雌猪数量（n=4）及各组仔猪总数。

为进一步探究分子机制，团队对术后8周的海绵体组织进行单细胞RNA测序，鉴定出内皮细胞（ECs）、成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞、雪旺细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞等8个主要细胞簇（图3a）。与单纯植入组相比，MSCs+植入组中血管生成相关通路和VEGF信号通路显著上调（图3b-c）。在内皮细胞的9个亚群中，亚群9（EC9）在MSCs+植入组中比例显著增加（图3d），伪时间轨迹分析显示EC9为终末分化内皮细胞（图3e），其糖酵解和氧化磷酸化相关基因表达上调（图3f-g），提示线粒体能量产生增强对内皮功能至关重要。同时，EC9中与髓系白细胞活化、免疫应答激活和中性粒细胞趋化相关的通路显著下调（图3h-i），KEGG分析显示白细胞跨内皮迁移和黏附分子通路也明显下调（图3j-k），表明MSCs移植显著减轻了内皮细胞的炎症反应。此外，成纤维细胞和平滑肌细胞中与炎症相关的通路同样被下调，而组织再生和血管再生通路在部分成纤维细胞亚群中上调，证实MSCs在促进血管再生的同时，全面抑制了阴茎组织的炎症微环境。

图3. 单细胞测序显示EC9细胞中血管生成增加且炎症反应减少。 a，所有海绵体细胞的UMAP图（来自植入组和MSCs+植入组各3个样本），细胞按簇着色。 b，血管生成相关基因表达水平的小提琴图结合箱线图。统计检验使用R中双尾Wilcoxon秩和检验。 c，ECs中富集前3通路的气泡图。颜色从浅蓝到红色表示基于Z评分的标准化基因表达水平，气泡大小表示P值由高到低。 d，各EC亚型百分比条形图。 e，ECs的伪时间分析。线条表示由表达谱定义的不同细胞命运。 f–g，糖酵解和氧化磷酸化相关基因表达水平的小提琴图结合箱线图。统计检验使用R中双尾Wilcoxon秩和检验。 h–i，GSEA显示MSCs+植入组中免疫应答激活和髓系白细胞激活信号显著下调。 j–k，GSEA显示MSCs+植入组中黏附分子和白细胞跨内皮迁移信号显著下调。

研究进一步聚焦免疫微环境调控。巨噬细胞是损伤重塑中最丰富的免疫细胞，团队将其分为促炎M1型和抗炎M2型（图4a）。在MSCs+植入组中，M1巨噬细胞的IL-10信号通路显著上调（图4f），而M2巨噬细胞中白细胞迁移、MHC IB类抗原加工呈递等通路被下调（图4g）。特别值得注意的是，M2巨噬细胞中与同种异体排斥相关的通路和多个相关基因表达显著降低（图4h-i），表明MSCs有效降低了宿主对移植物的排斥反应。在T细胞方面，MSCs+植入组中CD4+ T细胞比例显著减少（图5b），其T细胞免疫应答激活、IL-6产生和趋化因子分泌通路均被明显下调（图5c）。细胞间通讯分析显示，CD4+ T细胞与各内皮亚群之间的TGF-β信号交互减弱（图5d），而TGF-β正是诱导EndMT的关键分子。GSEA证实MSCs+植入组中所有内皮细胞的EndMT通路均显著下调（图5e），且EndMT相关基因表达减少，而内皮标志物CD31和CD34表达升高（图5f）。免疫荧光染色进一步证实，MSCs+植入组中同时表达α-SMA（平滑肌标志物）和CD31（内皮标志物）的细胞数量明显减少（图5g-i），表明MSCs联合仿生海绵体能有效缓解EndMT，促进血管再生。

图4. MSCs减少巨噬细胞炎症反应。 a，巨噬细胞亚群的UMAP图。 b，总巨噬细胞中血管生成相关基因表达水平的小提琴图结合箱线图。统计检验使用R中双尾Wilcoxon秩和检验。 c，M1和M2巨噬细胞百分比条形图。 d–e，M1和M2巨噬细胞中上调和下调差异表达基因的火山图。 f，GSEA显示MSCs+植入组中M1巨噬细胞的IL-10信号显著上调。NES，标准化富集分数。 g，各M2巨噬细胞GSEA结果的气泡图。颜色从浅蓝到红色表示基于Z评分的标准化基因表达水平，气泡大小表示P值由高到低。 h，GSEA显示MSCs+植入组中M2巨噬细胞的同种异体排斥反应显著下调。 i，MSCs+植入组中M2巨噬细胞与同种异体排斥相关基因下调表达的条形图。

图5. MSCs联合仿生海绵体缓解EndMT。 a，T细胞亚群的UMAP图。 b，T细胞亚群百分比条形图。 c，CD4+ T亚群GSEA结果的气泡图。颜色从浅蓝到红色表示基于Z评分的标准化基因表达水平，气泡大小表示P值由高到低。 d，利用CellChat分析的CD4+ T细胞与主要亚群间TGF-β信号网络的细胞间通讯。线条宽度表示配对数，不同颜色代表不同信号来源。 e，总ECs中EndMT相关TGF-β受体信号通路基因表达水平的小提琴图结合箱线图。统计检验使用双尾Wilcoxon秩和检验。 f，描绘总ECs中EndMT和EC命运相关基因差异表达的mRNA转录谱热图。 g，海绵体中EC标志物CD31（红色）和SMC标志物αSMA（绿色）的免疫染色。EndoMT表达表示为每视野共表达EC和SMC标志物的细胞数。n=3头猪/组。比例尺：50 μm。 h–i，各EC亚型中αSMA和CD31表达水平的小提琴图结合箱线图。

综上，该研究首次成功构建了具有仿生结构特征的海绵体模型，并负载MSCs，在猪模型中实现了阴茎组织结构与功能的双重修复。单细胞测序揭示了MSCs通过促进血管生成、抑制CD4+ T细胞介导的EndMT、重编程巨噬细胞免疫微环境并减轻同种异体排斥的综合调控网络。尽管目前仅在猪模型中验证疗效，且MSCs的来源、存活率和定植效率仍需进一步优化，但该策略为阴茎损伤修复提供了与组织结构高度相容的高效治疗思路。未来通过优化明胶组分以降低免疫原性、工程化改造MSCs增强疗效，有望推动该仿生支架向临床转化，为ED患者带来根本性治疗突破。