New Phytol | 河北农业大学赵勇团队揭示小麦产量及钾素利用效率协同调控新机制

近日，河北农业大学赵勇教授课题组在New Phytologist期刊在线发表了题为lncRNA62732 acts as an eTM of miR9778 to regulateTaHAK18-5Band mediate the potassium deficiency response in wheat的研究论文。该研究系统揭示了lncRNA62732-miR9778-TaHAK18-5B基因模块调控小麦钾素营养的分子机制，为小麦钾高效分子育种提供了新的基因资源。

钾（K⁺）是植物生长发育所必需的矿质元素，在植物细胞生命活动及抗逆过程中发挥至关重要的作用。为应对不同的供钾环境，植物演化出了复杂的分子调控网络。其中，HAK/KUP/KT家族是植物中最大的钾转运蛋白基因家族，广泛参与植物K⁺吸收与转运，该家族在小麦中仅有少数成员被鉴定，其上游调控网络，特别是非编码RNA（lncRNA/miRNA）如何作为关键调控因子参与低钾胁迫响应仍不清楚。因此，解析非编码RNA介导的钾素调控机制，不仅有助于深化小麦应答低钾逆境适应性的理解，也为小麦钾高效分子育种提供了新的基因资源。

miR9778通过靶向TaHAK18-5B负调控小麦低钾耐受性

研究团队前期通过小RNA测序鉴定到一个小麦族特异的小分子RNA miR9778，该基因在低钾处理下显著下调，表明其可能介导小麦的低钾胁迫响应。本研究利用CRISPR-Cas9技术创制了miR9778敲除突变体。表型鉴定发现，在正常钾条件下，突变体与野生型之间无显著表型差异；而在低钾条件下，突变体植株的表型优于野生型，根长、地上部长度、生物量及植株K⁺含量均显著高于野生型，证实miR9778是小麦耐低钾性的负调控因子。进一步结合生物信息学预测及RNA-seq数据分析，在根系中鉴定到低钾条件下的8个差异表达miR9778靶基因，其中仅钾转运蛋白基因TaHAK18-5B显著上调，与miR9778的表达模式相反，表明miR9778可能通过靶向TaHAK18-5B介导植株的低钾胁迫调控。通过降解组测序、5′-RACE及双荧光素酶报告等实验，进一步证实miR9778在TaHAK18-5BCDS区的第2219位核苷酸处切割。以上结果表明，TaHAK18-5B是miR9778的直接靶基因，其表达受miR9778负调控（图1）。

图1 miR9778靶向切割TaHAK18-5B

TaHAK18-5B正调控小麦苗期低钾耐受性

在正常 供 钾 水平 下， TaHAK18-5B 过表达株系与野生型之间无显著表型差异；而在低钾胁迫下， 相较于野生型， 过表达 TaHAK18-5B 植株 叶片萎蔫、黄化及生长抑制 程度显著减轻， 根系 及 地上部长度 、 干重 、 K⁺ 含量 和 浓度 均显著升高 （图2） ，表明 TaHAK18-5B 过表达 显著增强了小麦的低钾耐受性 。相反， 沉默 TaHAK18-5B 则显著降低小麦的低钾耐受性 。以上结果表明， TaHAK18-5B 在小麦苗期正调控 低钾 胁迫耐受性并促进 植株的 K⁺ 积累。

图2 过表达TaHAK18-5B显著提高小麦苗期低钾耐受性

lncRNA62732作为miR9778的eTM正向调控TaHAK18-5B的表达

长链非编码RNA（lncRNA）可作为内源性靶标模拟物（eTM）吸附miRNA，从而解除miRNA对靶基因的抑制。为探究miR9778的潜在eTM，团队对低钾耐受型小麦品种“河农9204”和敏感型品种“百农207”进行lncRNA测序。低钾胁迫下，在2个品种中分别鉴定到20个和18个差异表达lncRNA（图3a-b）。进一步通过Ssearch36和RNAhybrid预测到6个可作为miR9778潜在eTM的候选lncRNA（图3c）。结合根部低钾应答的lncRNA-Seq数据分析发现，仅lncRNA62732在耐低钾品种中显著上调，且表达模式与miR9778相反，是miR9778应答低钾胁迫的关键候选eTM。

图3 低钾响应差异表达lncRNA鉴定

RNAhybrid预测表明，lncRNA62732序列中存在与miR9778互补的结合位点，并在第9-10位核苷酸处形成典型的三核苷酸凸起（bulge），符合eTM的配对特征。烟草瞬时表达实验证实，lncRNA62732与miR9778共表达可显著缓解miR9778对TaHAK18-5B的抑制；而当lncRNA62732的结合位点发生突变（mlncRNA62732）后，这种“海绵效应”消失（图4）。双荧光素酶报告实验进一步证实，lncRNA62732通过竞争性结合miR9778，保护TaHAK18-5B转录本免于降解。综上，lncRNA62732通过作为miR9778的eTM，竞争性结合miR9778，从而正调控TaHAK18-5B的表达。

图4 lncRNA62732在小麦中作为miR9778的eTM

lncRNA62732作为非编码RNA正调控小麦的低钾耐受性

序列分析表明，lncRNA62732是位于小麦7B染色体上的基因间区lncRNA。编码潜力预测与功能验证表明其不具备编码蛋白的能力，为非编码RNA（图5）。与野生型相比，过表达lncRNA62732株系中miR9778的积累显著下降，而TaHAK18-5B的表达显著上调，进一步证实lncRNA62732通过作为miR9778的eTM，减弱miR9778对靶基因TaHAK18-5B的切割。在低钾胁迫下，过表达lncRNA62732株系的地上部和根系长度、干重均显著高于野生型，植株K⁺浓度与含量也明显增加。以上结果表明，lncRNA62732作为非编码RNA，正调控小麦苗期低钾耐受性。

图5 lncRNA62732的编码潜力分析

lncRNA62732-miR9778-TaHAK18-5B模块介导根系K+吸收及根部至地上部的K+转运

通过酵母异源表达和植株K⁺吸收、转运相关指标测定，系统解析了该模块的生理功能。酵母异源互补实验和铷离子（Rb+，K+示踪剂）吸收动力学分析表明，TaHAK18-5B能够回补K+吸收缺陷型酵母菌株在低钾培养基上的生长缺陷，具有典型的高亲和力K+转运蛋白活性。在小麦中，低钾胁迫下过表达TaHAK18-5B显著提高了根系K+浓度、K+含量和K+净吸收速率，地上部K+浓度、K+含量、K+转运效率及木质部伤流液K+浓度均显著提高；沉默株系则表现相反。值得注意的是，过表达TaHAK18-5B对韧皮部伤流液K+浓度无显著影响。lncRNA62732过表达株系和miR9778沉默株系的表型与此一致，共同证实lncRNA62732-miR9778-TaHAK18-5B模块正向调控低钾下根系K+吸收和根部至地上部的K+转运，但不参与K+由地上部向根部的再分配。

图6 TaHAK18-5B具有高亲和力K+转运蛋白活性

lncRNA62732-miR9778-TaHAK18-5B模块可提高小麦钾素利用效率与产量

为探究该模块在产量改良中的应用潜力，本研究在田间条件下比较了野生型与模块成员转基因株系的相关农艺性状（图7）。相较于野生型，敲除miR9778、过表达lncRNA62732或TaHAK18-5B在正常和低钾条件下均显著增加了单株穗数、产量和钾素利用效率，且在低钾条件下增幅更为显著。综上，lncRNA62732-miR9778-TaHAK18-5B模块可提高小麦产量与钾素利用效率。

图7 lncRNA62732-miR9778-TaHAK18-5B基因模块协同调控小麦钾素利用效率与产量

提出了lncRNA62732-miR9778-TaHAK18-5B基因模块协同调控小麦低钾耐受性及钾素利用效率的模型

本研究提出了低钾应答的关键模块lncRNA62732-miR9778-TaHAK18-5B，系统阐明了该模块在小麦响应低钾胁迫及提高钾素利用效率中的新机制（图8）。长链非编码RNA lncRNA62732作为miR9778的eTM，竞争性结合miR9778，抑制miR9778对其靶基因TaHAK18-5B的切割，从而正调控小麦的K⁺吸收及根部向地上部的转运，协同提高小麦的钾素利用效率（KUE）和产量。这一发现不仅拓展了对植物非编码RNA在钾素营养中的理解，也为小麦钾高效分子育种提供了新的候选靶点。

图8 lncRNA62732-miR9778-TaHAK18-5B模块调控小麦钾缺乏响应的模型

河北农业大学农学院赵勇教授、生命科学学院杨学举教授及周春江教授为该论文的共同通讯作者，青年教师徐渴、赵思航博士为论文共同第一作者。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金以及河北省自然科学基金等项目的资助。

https://doi.org/10.1111/nph.71456