错步行为分析系统 | 电针通过促进Nrf2核转位和激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 通路减轻缺血性中风中的铁死亡

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电针(EA)已被证明在缺血性中风后起到神经保护作用，但其潜在机制仍不清楚。铁死亡已被证明在损伤过程中起着关键作用。本研究旨在探讨电针是否通过促进核因子红系相关因子2(NRF2)核转位来抑制铁死亡。

1.电针对MCAO/R引起的脑损伤的神经保护作用

作者团队在MCAO/R后第7天通过NSS和Garcia评分来测量神经功能恢复情况。 结果表明MCAO/R组大鼠神经功能明显受损。电针治疗较MCAO/R组显著改善神经功能缺损（图1A)。 同样，MCAO/R 组的Garcia评分显著低于 Sham组，并且EA治疗改善了 Garcia 评分（图1B)。 错步实验（图1C）和转棒测试的结果（图1D）显示，与 MCAO/R 组相比，MCAO/R + EA 组的运动能力有所增强。

随后通过TTC染色在MCAO/R 手术大鼠中观察到严重的脑梗塞。发现EA+MCAO/R组的脑梗塞体积减少（图1E，F）。 同时尼氏染色显示，与Sham组相比，MCAO/R组神经元细胞排列紊乱或缺失，尼氏体染色不完全甚至溶解，提示MCAO/R造模诱导了神经元损伤。 与未治疗的缺血大鼠相比，经EA治疗的缺血大鼠的梗塞体积减少，神经元细胞恢复（图1G）。

图1 EA对脑MCAO/R诱导损伤的神经保护作用。

2.EA可减轻MCAO/R诱导的铁死亡

相对于假手术组，MCAO/R 组和 EA + MCAO/R 组的 MDA水平（图2A）和 Fe2+（图2B）水平明显升高。

同样，铁死亡相关蛋白GPX4的表达与之相似（图2C，D）：相较于假手术组，MCAO/R 组的谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、铁蛋白重链1（FTH1）表达水平均大幅降低；而电针干预可逆转上述改变（图2E，F）。

图2 EA抑制MCAO/R后大鼠铁死亡。

铁死亡会损害线粒体的结构和功能障碍。 我们通过TEM观察了线粒体超微结构。 MCAO/R 后样品表现出不规则的线粒体形态、空泡增殖和线粒体膜内陷，而 MCAO/R + EA 组的线粒体形态标准化，空泡较少（图3）。

图3 EA抑制MCAO/R后大鼠铁死亡。

3.EA增加Nrf2的表达，并促进Nrf2磷酸化和核转位

为了探究 EA 抗铁死亡潜力的分子机制，研究人员确定了Nrf2途径的一个关键因素（图4A、B）。结果显示，MCAO/R组中Nrf2和HO-1的表达和磷酸化水平都明显下调（图4C、D）。有趣的是，细胞核Nrf2在 MCAO/R 组中略有升高，在 EA + MCAO/R 组中显着升高，而细胞质 Nrf2 在 MCAO/R 组和 EA + MCAO/R 组中显著减少（图4E），我们进一步通过共聚焦观察了 Nrf2 的定位。 我们的研究结果证实，MCAO/R组中Nrf2主要积聚在细胞质中，EA有效促进Nrf2的核转位（图4G）。这些结果表明 EA 促进了 Nrf2 的磷酸化和核转位。

图4 增加Nrf2的表达并促进Nrf2磷酸化和核转位。

4.brusatol降低Nrf2含量，抑制Nrf2磷酸化和核转位

为了进一步验证Nrf2在MCAO/R诱导的铁死亡中的作用，我们通过brusatol抑制Nrf2。 采用蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测总Nrf2（图5A、B）、磷酸化 Nrf2（图 5C）、血红素氧合酶1（HO-1）（图 5D）、细胞核内Nrf2（图 5E）、细胞质 Nrf2（图 5F） 的蛋白表达水平。结果表明，brusatol 逆转了 EA 处理诱导的表达增加和促进核转位的影响。

我们进一步通过免疫荧光观察了Nrf2的位置（图5G）。结果表明，电针处理提高了MCAO/R + EA组中Nrf2的含量并吸引了Nrf2的核转位，而brusatol显著抑制了Nrf2的核转位。上述结果证实，brusatol明显抑制Nrf2和HO-1的总含量，并抑制EA处理后Nrf2的磷酸化和核转位。

图5 brusatol降低Nrf2含量，抑制Nrf2磷酸化和核转位。

5.brusatol减轻电针所致的MCAO/R后铁死亡

与 MCAO/R +EA+DMSO组相比，MCAO/R +EA+ brusatol组的亚铁离子（Fe²⁺）含量（图6A）、活性氧水平（图6B）、丙二醛（MDA）（图6C）含量均显著升高，超氧化物歧化酶（SOD）水平（图6D）则显著降低，同时蛋白免疫印迹结果显示，brusatol可显著下调铁死亡相关蛋白GPX4（图6E、F）、SLC7A11（图6G）及FTH1（图6H）的表达。

进一步采用双免疫荧光染色检测 GPX4 的表达水平，结果显示GPX4主要与神经元共定位（图6I）。与 GPX4 蛋白定量结果一致，brusatol能够逆转电针介导的 GPX4 上调效应（图6J）。上述结果证实，brusatol可通过抑制 Nrf2 通路，抵消电针产生的脑保护作用。

图6 brusatol可减弱EA的保护作用，从而减轻MCAO/R后的铁死亡。

接下来，使用TEM观察线粒体的形态。 如图所示，Sham组线粒体外膜完整，嵴丰富，形态正常，MCAO/R导致线粒体碎片化，嵴减少，甚至出现空泡化，这是铁死亡的特征。然而，EA抑制 MCAO/R诱导的线粒体形态变化（图7）。 相比之下，brusatol逆转了EA对线粒体的有利作用。

图7 brusatol可减弱EA的保护作用，从而减轻 MCAO/R 后的铁死亡。

6.brusatol可逆转EA的神经保护作用

随后，通过行为学检测与 TTC 染色评估brusatol对电针神经保护作用的干预效果。结果显示：与 MCAO/R +EA+DMSO组相比，MCAO/R +EA+brusatol组大鼠神经功能缺损评分（NSS）显著升高（图8A），Garcia神经功能评分显著降低（图8B）。错步实验（图8C）与转棒实验（图8D）结果趋势一致：MCAO/R + EA+ brusatol组大鼠运动功能恢复情况劣于MCAO/R +EA+DMSO组。

TTC染色结果表明，MCAO/R + EA+ brusatol组大鼠脑梗死体积显著大于MCAO/R + EA+ DMSO组（图8E、F）。同时尼氏染色结果显示，MCAO/R+EA+brusatol组脑梗塞体积增大，神经细胞排列紊乱，脑损伤更严重（图8G）。这些结果表明EA提供了针对中风的神经保护作用，而神经保护作用因 Nrf2 的抑制而减弱。

图8 brusatol可逆转EA的神经保护作用。

结论

在本研究中，我们建立了大鼠MCAO/R模型，并从建模后第1天开始连续7天进行电针治疗，最终减少了梗塞体积，改善了神经功能和运动行为评分。 可能的神经保护机制是EA通过促进Nrf2核转座和激活Nrf2/SLC7A11/GPX4通路减轻MCAO/R诱导的铁死亡。

作者提示: 个人观点，仅供参考

SA116 错步行为分析系统

Foot-Fault错步试验分析系统用来详细评估大小鼠在面对运动协调和平衡挑战时的表现，与步态分析系统类似，都是在动物行走过程中快速识别并计算步伐错乱现象。广泛应用于运动失调Ataxia、酒精中毒Alcoholism、帕金森症Parkinson、脑损伤Brain Injury、脊椎损伤Spinal Cord Injury的研究。

在错步实验中，动物被置于不同尺寸网格的平台上。动物被鼓励在这个平台上行走或跑动，软件自动记录动物在实验过程中踏空或失去平衡的次数。每当动物的一只脚未能正确落在棒或网格上，而是踏入了预设的“空”区域，这就被记录为一个“踏空”错误。 通过量化这些错误，研究人员可以获得关于动物运动协调性和平衡控制能力的重要数据。