冷热板测痛仪 | Sephin1通过保护脑出血后少突胶质细胞减轻白质损伤

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脑出血（ICH）引起的白质损伤（WMI）是与神经功能损伤密切相关的主要神经病理学特征。 少突胶质细胞 (OL) 负责修复 WMI，在 ICH 后经历血肿压迫和继发性神经炎症诱导的细胞死亡。 Sephin1 是 PPP1R15A 的选择性抑制剂，已被证明可以通过延长综合应激反应 (ISR) 来减少一般蛋白质合成并保护 OL。 在此，我们评估了用 Sephin1 或媒介物治疗的 ICH 小鼠的神经功能缺损和 WMI 的表现。

1.脑出血导致严重的白质损伤

脑白质和OL损伤与脑出血后神经功能损害密切相关，根据所述的诱导脑出血的方法，脑冠状切面显示血肿位于CC和EC下方。CPU和CC被设置为评估脑出血后WMI的区域(图1B)。LFB染色显示脑出血后血肿周围中央和中央的中央和中央有严重的WMI(图1C和D)。脑冠状切片免疫组织化学染色显示脑出血后血肿与OLS之间的空间关系(图1E)。

脑出血后3天，血肿核心区几乎所有的OL和其他细胞完全消失。到第7天，两组脑出血组的OL显著增加，并在血肿周围形成环状。

图1 ICH导致严重的WMI并明显减少血肿周围区域的OLs数量。

2.Sephin1缓解WMI并改善ICH后的长期神经功能

MBP 免疫荧光染色显示 ICH 后血肿周围 CPu 和 CC 中存在显著的 WMI（图2A）。定量分析显示，ICH后14天和28天，Sephin1组血肿周围CPu和CC的MBP平均荧光强度（MFI）显著增加（图2B和C）。这些结果表明 Sephin1 减轻了 ICH 后的 WMI。 也表明 Sephin1 改善了 ICH 后的长期神经功能。在ICH后7/14/21/28天，Sephin1组小鼠的mNSS评分低于载体组（图2D）。 转棒测试显示，Sephin1处理的小鼠的感觉运动协调性和抗疲劳能力有改善（图2E）。 Sephin1处理的小鼠表现出标准化前肢握力显著增强（图2F）。在 ICH 后 7 天和 14 天，Sephin1 处理的小鼠中由 ICH 引起的明显感觉缺陷得到缓解（图2G）。 在平衡木测试中，Sephin1处理的小鼠在7/14/21天进入暗箱所需的时间减少（图2H）。

图2 Sephin1缓解WMI并改善ICH后的长期神经功能。

3.Sephin1 增强血肿周围区域的髓鞘再生

TEM 用于研究轴突的超微结构变化并测量血肿周围 CC 中髓鞘的厚度。 假手术组轴突完整，髓鞘致密，细胞器规则。 相反，轴突肿胀、脱髓鞘或破裂； ICH组观察到线粒体增大或空泡化，Sephin1组这些症状明显改善（图3A）。 ICH后有髓轴突的数量和髓鞘的厚度减少，通过Sephin1给药改善（图3B-D）。 ICH后14天和28天，Sephin1处理的小鼠的g比率定量比载体处理的小鼠低得多（图3E）。 此外，轴突直径与髓磷脂厚度的散点图显示，与载体组相比，Sephin1 组中的髓磷脂厚度大大增加（图3F）。

图3 Sephin1促进ICH后血肿周围CC的髓鞘再生。

4.Sephin1增加了血肿周围区域的OLs数量

我们通过 Olig2 和 DAPI 的免疫荧光染色，量化了 ICH 后 3-28 天血肿周围 CPu 和 CC 中 OLs 数量的时间变化。 ICH 后 7 天，两个 ICH 组血肿周围 Olig2+ 细胞的密度均增加，但在 14 和 28 天时逐渐下降（图4A和B）。细胞凋亡是OLs死亡的主要途径，可以通过延长ISR来抑制细胞凋亡。实验表明Sephin1为OL提供了有效的保护（图4C）。OPCs具有增殖和分化为成熟 OLs 的能力。12 在血肿周围区域，使用 NG2 和 Olig2 联合标记的细胞来识别 OPCs。 与载体处理的小鼠相比，Sephin1 处理的小鼠中 OLs 中 OPCs 的数量和比例增加（图4D）。

图4 Sephin1 增加了血肿周围区域的 OL 数量。

5.Sephin1调节小胶质细胞极化并减少促炎细胞因子的释放

ICH 后，神经元和其他细胞释放的促炎分子导致小胶质细胞激活。激活的小胶质细胞极化为促炎或抗炎表型，促炎小胶质细胞加剧 ICH 后的 OL 死亡和 WMI。与媒介物组相比，Sephin1 处理的小鼠在 ICH 后3和7天的 CD16/CD32+Iba1+ 细胞数量减少，表明给予 Sephin1 调节小胶质细胞/巨噬细胞的极化（图5A和B）。 ICH后第3天和第7天,与假手术组相比,ICH组血肿周围组织中IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的表达水平均升高。 与vehicle组小鼠相比，Sephin1组小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的表达水平降低（图5C-F）。

图5 DMX对压力的反应并刺激肝脏LCN2。

6.Sephin1保护OLs的分子机制

ISR的激活充当细胞凋亡的调节剂，此处通过对血肿周围区域脑组织裂解物进行蛋白质印迹分析证实了 ISR 相关信号通路的激活（图6A）。 P-eIF2α 的表达水平在各组之间存在差异，在 ICH + Sephin1 组中观察到最高水平（图6B）。 此外，定量分析表明，与媒介物处理的小鼠相比，Sephin1 处理对 CHOP 表达的显著抑制。 在本研究中，血红蛋白刺激的原代 OLs 和小胶质细胞在 Transwell 系统中共培养24小时（图6B–D）。用Sephin1处理的OLs的细胞活力高于用媒介物处理的OLs，这意味着Sephin1可以在促炎环境中保护OLs（图6E）。

图6 当与激活的小胶质细胞共培养时，Sephin1可以保护OLs。

7.GADD34缺陷可改善 WMI 并保护 OLs

按照与上述相同的步骤，在8周龄雄性GADD34突变小鼠和野生型小鼠（25-30 g）中诱导 ICH。与野生型小鼠相比，GADD34 突变小鼠的 WMI 显著改善（图7A），与Sephin1类似，GADD34缺失改善了ICH后的长期神经功能（图7B）。GADD34突变小鼠在ICH后7天和14天增加了血肿周围的OLs数量（图7C），并在3天和7天保护OLs免于凋亡（图7D）。 随后，我们检查了血肿周围的促炎小胶质细胞。 与野生型小鼠相比，GADD34突变小鼠在ICH后第3天和第7天显示促炎小胶质细胞数量显着减少。 这些发现表明，GADD34 失活可以重现Sephin1对ICH中OLs的保护作用。

图7 GADD34缺陷能改善WMI并保护OLs。

结论

总结全文，在本研究中，我们确定了 Sephin1 在保护OLs和改善WMI方面的作用。 Sephin1显著减轻了WMI并促进血肿周围区域受损轴突的髓鞘再生，同时改善长期神经功能。 Sephin1还抑制OLs的凋亡，促进OLs的增殖，并增加ICH后血肿周围区域OLs的数量。 Sephin1 治疗可抑制小胶质细胞向促炎表型的极化，并减少血肿周围组织中促炎细胞因子的释放。

在该研究中，研究人员使用了赛昂斯冷热板测痛仪（Sansbio，SA705）和大小鼠平衡木（Sansbio，SA112）来进行实验操作。

作者提示: 个人观点，仅供参考

SA705 冷热板测痛仪

冷热板测痛仪是对急性疼痛镇痛药物的筛选实验开发的仪器，甩尾反射实验或动物足底触痛照射实验，但这些都是动物正常的刺激反应阈值，属于一种生理疼痛。生理性疼痛与病理性疼痛是有着本质上的区别，生理性疼痛是一种为生存进行自我保护的一套报警系统，而病理性疼痛是一种妨碍生存的疾病。由于两种疼痛的表现与发生机制不同，其对于镇痛药物的研究实验方法也不同，如有些镇痛药物对生理、病理性疼痛均有其较好的镇痛作用。但有些药物只对生理性疼痛有作用，所以用不同的实验方法实验仪器可筛选出作用点不同的药物。冷热板测痛仪是一种能将生理性疼痛实验与病理性疼痛实验在同一台仪器上完成的仪器。

SA112 大小鼠平衡木

平衡木是啮齿动物中运动协调和平衡的测试。该试验评估了运动皮层损伤，创伤性脑损伤，γ-氨基丁酸输注到额叶皮层和中风啮齿动物模型后的感觉运动功能。此外，该测试可用于评估衰老的影响和表征转基因