诺奖得主Doudna团队用AI发明新型“基因剪刀”，比天然的更好用

2020 年，珍妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）与埃玛纽埃勒·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）因共同开发 CRISPR-Cas9 基因编辑技术共获诺贝尔化学奖。

随着 AI 与大语言模型的爆发，近几年，珍妮弗的实验室逐渐将研究重心转向一个新方向：用人工智能（AI）创造自然界不存在的基因编辑工具。

7 月 16 日，珍妮弗团队在《科学》（Science）发文，介绍了一类名为 SynTnpB 的 AI 设计基因编辑蛋白。SynTnpB 蛋白在细菌类、动物和植物细胞中均表现出编辑活性，部分变体活性甚至超过天然酶。研究者还用冷冻电镜（cryo-EM）解析了其中一种变体的三维结构，并首次从原子层面剖析 AI 设计核酸酶的分子逻辑。

（来源：Science）

蛋白质通常由氨基酸序列折叠成不同三维结构得到。在 AI 蛋白质设计领域，AlphaFold 解决了结构预测问题，已有一些模型在结合蛋白、动态开关等相对简单的设计任务上达成目标，但对于具有多个功能结构域、多种构象状态的复杂酶，AI 一直难以设计出令人满意的结构。

尤其是 CRISPR-Cas 系统中的核酸酶，它们需要同时识别 RNA 和 DNA，并在不同催化状态间切换，才能精准剪切 DNA。

但用 AI 设计基因编辑蛋白不是此次团队的首创。2024 年，由前谷歌研究员创立的 AI 蛋白设计公司 Profluent 发布了 OpenCRISPR-1，声称是首个完全由 AI 生成的 CRISPR 编辑器。该蛋白与 SpCas9（当前应用最广泛的天然 Cas 核酸酶）有 400 余处突变差异，与最接近的天然同源物也有约 180 处差异，在人类细胞中显示出与 SpCas9 相当的编辑活性和更低的脱靶率。

新研究指出，尽管这些基于序列语言模型（LM）生成的蛋白，整体与天然序列存在数百处差异，其 DNA 结合结构域与天然同源物的序列一致性仍超过 99%，AI 做到的更接近"重排"而非"创造"。

AI 真正自主设计出的复杂酶，应在功能核心区域与天然酶发生大幅度的序列偏离，活性至少保持不变，甚至要做到更优。

为此，团队选择 TnpB（转座酶 B）作为验证对象。TnpB 因最初在转座子中发现而得名，被认为是 CRISPR-Cas12 的演化祖先。TnpB 仅有 408 个氨基酸，约为 SpCas9 的三分之一，但保留了 RNA 引导 DNA 切割的完整功能，识别和切割机制也与 Cas9 相似。TnpB 家族在细菌、古菌乃至真核生物中广泛存在，多样性丰富。

蛋白质的三维结构决定其功能，但不同的氨基酸序列可以折叠成相同的结构。研究团队使用了 Meta 于 2022 年发布并开源的逆向折叠模型 ESM-IF1，该模型基于 AlphaFold2 预测的 1,200 万个蛋白结构训练而成。在模型中给定一个蛋白骨架的三维坐标，即可生成与之相容的新氨基酸序列。研究者输入 TnpB 的结构，让 ESM-IF1 反推出全新的序列。

一开始，团队只用初始模型，得到的序列不够理想。ESM-IF1 能正确恢复 TnpB 的整体折叠和催化三联体结构，但在蛋白与核酸接触的界面上引入了错误突变。这代表 ESM-IF1 只能看懂蛋白的静态骨架，却并不了解 TnpB 的具体功能。

解决方案是为 AI 引入演化约束。研究者对天然 TnpB 进行多序列比对，最终提取出两类信号，一类是位置保守性，反映某个位置在自然选择中改变的频率；另一类是共进化耦合强度，反映蛋白残基与核酸碱基之间的共同演化关系。

两类信号条件都满足的残基被锁定为野生型序列，其余位置交给 ESM-IF1 自由生成。通过调节保守性和耦合强度，研究人员还能精确控制 AI 设计蛋白质的自由度：阈值越高，被锁定的残基越少，生成序列的差异化程度越大。

另一个关键的实验设计是分域策略。TnpB 由负责 DNA 识别的 REC 域和负责 RNA 结合与催化的 NUC 域构成。研究者将两个域分别设计并进行测试。结果发现，NUC 域对序列变化的兼容度远高于 REC 域。这一发现暗示，设计多结构域蛋白时，不能统一处理，需要对不同功能域独立优化。

研究人员让 AI 分别独立生成两个域的变体，再进行两两组合，最终得到 1,980 种全新的 TnpB 类蛋白，评估筛选后发现，其中 466 种具有可检测的切割活性，占测试总数的 24%，约 8% 的活性超过野生型 ISDra2 TnpB。研究者从中选出 9 个综合表现最佳的变体（v1 至 v9）进入真核细胞测试。

在人类胚胎肾细胞（HEK293T）敲除实验中，野生型 TnpB 的编辑效率为 28%，v1 和 v5 分别达到 46% 和 50%；在内源基因位点上，v1 在 EMX1 位点的编辑效率甚至是野生型的 3.8 倍；特异性方面，v1 与野生型相当；在拟南芥的基因编辑实验中，v1 在几乎所有测试靶点上都优于野生型。

AI 生成变体中，离天然蛋白“最远”的是 v7，其与野生型 ISDra2 TnpB 的一致性仅为 77%，偏离程度远超此前序列语言模型设计出的蛋白。

为探究原因，研究者对 v7 在两个催化状态下的三元复合物（蛋白-RNA-DNA）分别进行冷冻电镜解析，并通过实验验证功能。

结果发现，在 RNA-蛋白界面，AI 引入的残基突变构建了一个正电荷富集区，与保留下来的野生型残基协同稳定 RNA 骨架。在 REC 域，生成的残基与 RNA-DNA 异源双链形成新的接触。而在催化裂缝上方，AI 还直接设计出了野生型 TnpB 中不存在的分子接触。

（来源：Science）

需要明确，ESM-IF1 训练时并未接触任何核酸序列信息，它从蛋白结构中推断出的残基排布却与 TnpB 的构象运动高度契合。

研究者据此推测，逆向折叠模型可能自发学到了与核酸结合和构象转换相容的序列约束。这一结论如果成立，有助于我们更深入地理解大型蛋白质模型的内部表征。

实验证实，AI 从结构与进化信息中独立“发现”的突变，确实部分具备提升编辑活性等功能。例如，一段几乎完全由 ESM-IF1 重新设计的螺旋片段，实现了野生型 TnpB 中类似结构促进异源双链形成的功能。

在基因编辑领域，即便能通过 AI 工具设计更强大的 TnpB 体系，但因识别与激活切割的机制更为严格，TnpB 的编辑效率依然低于 SpCas9 系统，可用性不及后者。

但 TnpB 可以在一些特殊领域发挥作用。在基因治疗领域，常用的载体是腺相关病毒（AAV），其递送载体装载上限为 4.7 kb。但 SpCas9 的编码序列长达 4.1 kb，加上启动子和调控元件后很容易“超载”。这时，编码序列仅约 1.2 kb 的 TnpB 就派上了用场。

此前，野生型 TnpB 的切割活性不足，但 AI 设计出的 SynTnpB v1 和 v5 变体，已经能将部分位点的编辑效率提升至与 Cas9 相近的水平。

作为 CRISPR 基础生物学发现者和多家基因编辑公司（Caribou、Intellia、Mammoth、Scribe 等）的联合创始人，珍妮弗的产学连结网有望推动这类新技术加速走向临床应用。

从 2012 年发现 CRISPR-Cas9，再到如今用 AI 创造全新核酸酶，科学家开始不满足于翻找大自然的工具箱，还想亲自造一把更趁手的。未来，团队希望更进一步，深入探索从头设计（de novo design），以此扩展可设计的蛋白质空间。

参考内容：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.aed6123

运营/排版：何晨龙

注：封面/首图由 AI 辅助生成诺奖得主Doudna团队用AI发明新型“基因剪刀”，比天然的更好用