研究“蛋白-RNA互作”的几种经典技术以及注意事项

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（来源：小张聊科研）

今天我们来介绍总结蛋白与RNA互作的技术以及相关注意事项，技术上我们重点介绍这几种经典的实验：RNA pulldown、RIP-Seq、CLIP-Seq和RNA EMSA实验、RNA与蛋白共定位。

1.RNA与蛋白互作可以从RNA和蛋白这两个角度展开。从RNA的角度来说：RNA与蛋白的互作可用于解释RNA的稳定性变化、RNA翻译、RNA定位等过程，因此在进一步研究RNA与蛋白互作之前，一般都要先确认RNA本身发生的这些改变，特别是有不少项目关注的是RNA修饰（比如RNA m7G等），然后再通过与之结合的蛋白进一步说明具体的方式（RNA结合蛋白）；另外一个角度就是蛋白，虽然主要是RNA结合蛋白这一类，但由于RNA结合蛋白类型很多，还要具体分类，比如RNA 修饰Reader蛋白、翻译因子、RNA转运蛋白等等；

2.虽然现在有很多在线工具可以预测RNA-蛋白互作，但是这些工具大多有一个缺陷：没有考虑到组织或者细胞特异性，即虽然预测到某个RNA与蛋白可能结合（甚至有很高的“打分”），但不能说明在申请人研究背景下（比如在心肌细胞、巨噬细胞）也能结合，比如有的蛋白或者RNA可能有很高的组织表达特异性（组织或者细胞特异性表达的），换个细胞或者组织就不表达了，这也是预测蛋白-蛋白互作很常见的一个问题；

3.与之前我们说的蛋白-蛋白互作相比，在细胞体系的RIP-Seq、RNA pulldown这些实验并不能直接证明蛋白与RNA的互作，即有可能存在介导RNA与蛋白互作的间接介导因子B，即“RNA—间接因子B—蛋白”这种模式，而非“RNA—蛋白”的作用方式，因此还需要在非细胞体系下进一步证明；

4.像RNA pulldown和RIP-Seq这种技术多数情况下鉴定到的是RNA或者蛋白整体的结合，基本做不到氨基酸或者核苷酸分辨率的结合，因此如果要进行深入的机制研究，还需要对RNA和蛋白进一步进行截断实验和突变，从而确认具体的作用位置、结构域和位点；

5.其它的一些问题与蛋白-蛋白互作等很像，即要确认RNA与蛋白的互作，一般都需要几个方式一起来证明，如果只用一个技术来证明，很容易被质疑，比如有很多项目中证明RNA与蛋白结合，只有RIP-Seq和RNA pulldown就是不严谨的。

6.由于RNA pulldown、RIP-Seq这些技术主要是用于筛选的，因此后续一般也要通过WB、PCR或者qPCR等进行验证，而有很多项目在预实验层面会出在分组设置上，比如缺少Input、IgG对照、Negative/ Scramble阴性对照和阳性对照，这也是很多专家提出质疑的细节地方。

下面我们简单介绍一下这些技术，由于这些技术基本都是比较经典的，我们就不说的太详细了：

一、RNA pulldown——MS/WB

RNA pulldown是一种用于研究蛋白质与RNA之间的相互作用的实验技术。它的原理基于使用生物素标记的RNA探针作为“诱饵”，在细胞裂解液中捕获与之特异性结合的蛋白质。

大致流程：首先，设计并合成包含特定RNA序列的探针，并通过生物素进行标记以便于后续的检测和纯化。接着，将细胞裂解以释放蛋白质和RNA，然后与标记的RNA探针混合，允许探针与裂解液中的蛋白质相互作用。通过亲和层析技术，如链霉亲和素-琼脂糖珠，纯化与RNA探针结合的蛋白质。最后，通过WB或者质谱等方法鉴定或者验证这些蛋白。

二、RIP-Seq (RNA binding protein Immunoprecipitation Sequencing)

RIP-Seq（RNA免疫沉淀测序）是一种用于研究蛋白质与RNA相互作用的高通量测序技术。其原理是利用特定的抗体捕获与目标蛋白质结合的RNA分子，然后通过高通量测序技术对这些RNA进行测序和分析。

大致流程：首先，细胞被裂解以提取蛋白质-RNA复合物；然后，使用针对特定RNA结合蛋白的抗体进行免疫沉淀，这些抗体能够特异性地识别并捕获目标蛋白及其相关的RNA分子；接着，沉淀的复合物被洗涤以去除非特异性结合，然后释放RNA并进行纯化；之后，纯化的RNA分子被用于构建测序文库，并通过测序技术进行测序；最后，通过生物信息学分析，比较免疫沉淀样本与对照样本的测序结果，以鉴定与目标蛋白质相互作用的RNA分子；或者采用qPCR方法验证与蛋白结合的RNA。

三、CLIP-Seq（Crosslinking and Immunoprecipitation Sequencing）

CLIP-Seq是一种用于研究蛋白与RNA相互作用的高通量测序技术。其原理基于使用紫外线（UV）或化学交联剂对细胞进行交联处理，使RNA结合蛋白（RBPs）与其结合的RNA分子形成稳定的复合物，后通过抗体捕获并进行测序，以鉴定与蛋白结合RNA的序列位置。

大致流程：首先对细胞进行交联处理，使RBPs与RNA形成稳定的复合物；接着，使用针对特定RBP的抗体进行免疫沉淀，捕获这些蛋白质-RNA复合物；然后，纯化沉淀的复合物并释放RNA分子；之后，将纯化的RNA分子用于构建测序文库；最后进行高通量测序并对测序数据进行生物信息学分析，以鉴定RBPs的靶标RNA和精确的结合位点（大致区域，而不是精确到单个核苷酸水平的信息，如果要到单碱基水平，可以通过eCLIP/iCLIP等方法）。

四、RNA电泳迁移率分析（RNA Electrophoretic Mobility Shift Assay，RNA EMSA）

是一种用于研究蛋白质与RNA相互作用的实验技术。该技术基于蛋白质与RNA结合后，会形成较大的复合物，其在凝胶中的迁移速率会比单独的RNA分子慢。

大致流程：首先，合成或纯化目标RNA分子，并对其进行标记，通常使用放射性同位素（例如^32P）或非放射性标记物（如生物素或荧光标记）。接着准备待测的蛋白质，这些蛋白质可以是纯化的重组蛋白或从细胞中提取的蛋白。然后，将标记的RNA探针与蛋白质混合，并在特定的条件（如适宜的温度、离子强度和pH值）下孵育，以允许蛋白质与RNA发生结合。孵育后，将反应混合物加载到非变性聚丙烯酰胺凝胶上，并进行电泳。在电泳过程中，由于蛋白质-RNA复合物的迁移速率比自由RNA慢，它们会在凝胶中形成新的条带。最后，电泳完成后，通过放射自显影、化学发光或荧光成像等适当的检测方法来检测RNA探针和蛋白质-RNA复合物的条带。通过比较复合物和自由RNA的迁移距离，研究者可以判断蛋白质是否与RNA发生了结合以及这种结合的特异性。

五、RNA与蛋白共定位

与蛋白-蛋白共定位相似，这个实验是从形态上确定RNA与蛋白结合的比较重要的实验，因此是国自然项目中“必需”的实验了。RNA与蛋白共定位是指在细胞内RNA和蛋白质在亚细胞水平上的空间分布和相互作用。

（如果基金里面放上这样的图，会不会增加评审专家的印象分？）

大致流程：RNA与蛋白共定位的研究流程首先涉及样本的准备，包括培养细胞至适当密度并对细胞进行必要的处理，如转染、诱导表达或药物处理。接着，通过使用RNA标记技术，如荧光原位杂交（FISH）或RNA与绿色荧光蛋白（GFP）融合标签，对目标RNA分子进行标记。同时，目标蛋白质通过转基因、CRISPR/Cas9系统或免疫荧光技术与荧光蛋白融合或直接标记。然后，利用共聚焦显微镜或超分辨率显微镜对细胞内标记的RNA和蛋白质进行成像，捕获它们在亚细胞结构中的分布情况。之后，通过图像分析软件对获得的图像进行定量分析，评估RNA和蛋白质的共定位程度和分布模式。