浙江
稻瘟病是水稻生产上最具破坏性的真菌病害之一，其致病菌稻瘟病菌在侵染过程中会从活体营养阶段转向死体营养阶段，这一转变会触发寄主细胞的死亡，可是驱动该转变的分子机制一直没有被完全理解清楚。近日，南京农业大学张正光教授和刘昕宇教授团队在《自然·植物》期刊发表了题为《A fungal nuclease effector subverts the chloroplast genome and triggers cell death to promote infection》的研究论文，他们鉴定出一类此前未被发现的坏死性效应蛋白家族，并深入揭示了其中最关键的成员MoNee6靶向降解叶绿体DNA并诱导水稻细胞死亡的完整分子路径。
研究团队首先对稻瘟病菌在侵染中后期高表达的分泌蛋白进行了大规模筛选，他们从298个候选基因中鉴定出6个能够诱导寄主细胞死亡的坏死性效应子，其中MoNee6的致病贡献最为突出。敲除MoNEE6基因后，突变体菌株在水稻叶片上形成的病斑面积显著缩小，产孢量也大幅下降，并且在侵染水稻叶鞘细胞时无法像野生型菌株那样有效扩散到相邻细胞中。研究团队进一步利用荧光标记和免疫电镜技术追踪了MoNee6在寄主细胞内的分布情况，他们发现这个效应蛋白在分泌后会精准定位到水稻叶绿体内部，并且与叶绿素的自发荧光信号完全重合。
在明确MoNee6的叶绿体靶向特性之后，研究团队对它的生化功能展开了深入解析，他们通过AlphaFold3结构预测发现MoNee6含有一个保守的DUF1524核酸酶结构域，其中HxxP基序的组氨酸和脯氨酸残基构成了催化活性中心。体外核酸酶活性实验证实，纯化的MoNee6重组蛋白能够有效降解λ噬菌体DNA以及从水稻叶绿体和细胞核中提取的DNA，而当催化位点的关键氨基酸发生点突变之后，MoNee6的核酸酶活性就彻底消失了。研究团队还建立了雌二醇诱导型过表达水稻株系，他们发现诱导MoNEE6表达之后，叶绿体基因组编码的多个基因转录水平大幅下降，相比之下核基因组编码的基因受影响很小，这说明MoNee6在体内能够选择性地抑制叶绿体基因的表达。将野生型MoNee6和无核酸酶活性的突变体分别在本氏烟草叶片中瞬时表达后，只有野生型蛋白能够诱导明显的细胞坏死表型，而在水稻原生质体中表达野生型MoNee6后细胞死亡率也显著高于突变体处理组，这些结果共同证实了MoNee6的核酸酶活性是其诱导寄主细胞死亡并促进病菌致病性的直接原因。
水稻叶绿体并非对MoNee6的攻击毫无防御能力，研究团队发现寄主自身的Clp蛋白酶复合体能够识别并降解侵入叶绿体的MoNee6蛋白。他们通过亲和纯化联合质谱分析鉴定出多个Clp蛋白酶亚基与MoNee6存在物理互作，随后利用酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀等多种手段证实了MoNee6与OsClpP5和OsClpP6这两个核心亚基之间的直接结合关系。体外降解实验表明只有完整组装好的Clp蛋白酶复合体才能够逐步分解MoNee6，而过量表达单个亚基并不能增强这种降解效率。值得注意的是稻瘟病菌在侵染过程中会主动抑制叶绿体基因组编码的OsCLPP1基因转录，而OsClpP1恰恰是Clp蛋白酶复合体组装和发挥催化活性所必需的关键组分，病菌正是利用这种压制策略削弱了寄主自身的蛋白质量控制系统。研究团队将OsClpP1的编码序列改由核基因组表达，并且为其融合了来源于其他核编码叶绿体蛋白的转运肽序列，改造后的OsClpP1蛋白能够被高效运回叶绿体内部，重新恢复了Clp蛋白酶复合体对MoNee6的降解能力，并且这一遗传改良策略显著增强了水稻对稻瘟病的抗性，同时没有对株高、分蘖数、结实率和千粒重等重要农艺性状造成不利影响。
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