浙江大学李承喜&张治国JACS：PMDA四功能连接子实现赖氨酸选择性环化与自动化大环组装

导读

环肽因兼具较高构象稳定性、良好靶标识别能力和可调控的功能展示方式，已成为化学生物学和药物发现中的重要分子骨架。肽链“钉合”（peptide stapling）能够通过共价连接两个特定位点来限制肽链构象，从而提高抗蛋白酶降解能力和生物功能。然而，现有钉合策略往往依赖非天然氨基酸或半胱氨酸等特定反应位点，在底物适用性、化学选择性、后期功能化能力和自动化兼容性之间仍难以兼顾。

PMDA连接子驱动赖氨酸选择性环化、后期功能化与自动化大环组装

针对这一瓶颈，浙江大学李承喜教授和张治国教授报道了一种基于商业化小分子焦均苯四甲酸二酐（pyromellitic dianhydride, PMDA）的赖氨酸–赖氨酸选择性环化新策略。该方法利用PMDA的四功能反应特征，在温和条件下实现未保护肽中赖氨酸ε-氨基的高选择性分子内双酰胺化，同时保留两个羧酸手柄用于后续功能化。相关成果以“A Modular PMDA Linker Enables Lysine-Selective Cyclization of Unprotected Peptides and Automated Macrocycle Assembly”为题发表于Journal of the American Chemical Society。

PMDA连接子：一次反应，同时完成环化与功能手柄安装

PMDA通常用于聚酰亚胺等材料化学中，其酸酐结构可被胺类亲核试剂开环。作者注意到，含有两个赖氨酸的肽序列具有柔性ε-氨基和一定的分子内预组织效应，可能诱导PMDA优先发生分子内双酰胺化，而不是无序的分子间聚合或多位点修饰。基于这一设想，团队将PMDA重新定义为一种面向肽大环构建的四功能连接子：其中两个酸酐羰基与两个赖氨酸ε-氨基形成酰胺键，实现Lys–Lys stapling；另外两个开环后形成的羧酸则作为后续偶联和结构拓展的功能手柄。

因此，PMDA并不是一个简单的交联试剂，而是在一次反应中同时完成“环化”和“功能手柄安装”，从而为单环肽、双环肽以及多功能偶联物的构建提供了统一平台。

图1｜研究策略示意图。与已有Lys–Lys stapling策略相比，本工作使用PMDA作为四功能连接子，既实现赖氨酸选择性环化，又保留两个羧酸手柄用于后续功能化，并与固相/自动化合成兼容

温和而高选择性的非保护肽赖氨酸环化

作者首先以Ac-KFPFK-NH2作为模型底物，对碱、溶剂、温度和当量进行系统筛选。结果显示，在HFIP/MeCN体系中，以TMG为碱可以显著促进分子内双酰胺化，并抑制单修饰和二聚副产物的生成。优化后，模型肽环化可获得很高的LC估算收率。更重要的是，该反应表现出优异的氨基酸兼容性。

作者设计了覆盖Asp、Glu、Ser、Thr、Tyr、His、Trp、Met、Arg、Cys等多种潜在反应性侧链的未保护肽，LC-MS结果表明这些非赖氨酸残基均未发生可检测的PMDA衍生修饰，说明该体系对赖氨酸ε-氨基具有高度选择性。

图2｜PMDA介导Lys–Lys stapling的条件优化与化学选择性验证。TMG/HFIP–MeCN体系可高效促进模型肽分子内环化，并在多种活泼侧链存在时仍保持对赖氨酸ε-氨基的优异选择性

从底物拓展到双环化与后期偶联

在底物范围方面，作者系统考察了i+0到i+7不同间隔的赖氨酸位点，均可顺利发生分子内环化，说明该策略对环尺寸和间隔长度具有较强适应性。进一步地，在多种具有潜在抗菌活性的肽序列中，该反应同样能够稳定运行，表现出良好的序列适应性和官能团耐受性。

图3｜底物范围研究。无论是不同Lys间隔的底物，还是包含复杂侧链的肽序列，均可高效发生PMDA介导的大环化

PMDA环化产物中保留的两个羧酸手柄进一步打开了高阶结构构建空间。团队通过羧酸活化与第二段肽链接入，构建了一系列双环肽；同时还实现了与PNA、小分子药物氨氯地平以及生物素标签的双位点偶联，甚至获得同时含有氨氯地平和生物素的异双功能化产物。

图4｜PMDA环化产物的应用拓展。保留的双羧酸手柄可用于模块化构建双环肽，并可进一步实现PNA偶联、药物偶联和生物素标记等后期功能化

提升功能肽稳定性，并无缝接入自动化平台

为验证该策略在功能肽中的应用潜力，作者选择黄蜂毒素来源的抗菌肽anoplin作为模型。PMDA单环化和双环化显著提高了肽的蛋白酶稳定性；CD光谱显示，PMDA环化能够增强肽链构象约束；抗菌测试也表明，PMDA钉合后的肽对MRSA的活性优于相应线性肽。

图5｜PMDA钉合对功能肽性质的影响。以anoplin为模型，单环/双环化显著提升蛋白酶稳定性，并在MRSA测试中保持甚至改善抗菌活性

该化学策略还被成功移植到固相合成和自动化合成平台中。通过Alloc选择性脱保护后，PMDA可在树脂上实现赖氨酸侧链间环化。进一步地，团队将氨基酸组装、保护基操作和PMDA环化整合到CycloBot自动化平台中，在无需硬件改造的情况下实现端到端自动化大环组装。与手动固相流程相比，自动化流程显著缩短操作时间，并提高了目标环肽的合成效率。

图6｜PMDA介导环化与自动化合成兼容。作者在CycloBot平台上实现了从肽链组装、脱保护到PMDA环化的一体化自动流程，显著提升了宏环组装效率

总结与展望

这项工作将一个商业化、廉价易得的材料化学单体PMDA转化为面向环肽药物发现的四功能连接子，实现了未保护肽中赖氨酸选择性环化、双羧酸手柄安装、双环肽构建、多功能偶联以及自动化合成的集成。该策略为环肽分子的快速制备、后期修饰和自动化筛选提供了新的通用工具，也进一步拓展了可编程肽合成平台的化学能力。

论文第一作者为浙江大学吴嘉树、詹汪琳和杨星星，通讯作者为浙江大学李承喜教授和张治国教授。研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金创新研究群体、国家自然科学基金、博士后创新人才支持计划和中国博士后科学基金等项目支持。

论文信息

论文标题：A Modular PMDA Linker Enables Lysine-Selective Cyclization of Unprotected Peptides and Automated Macrocycle Assembly

论文作者：Jiashu Wu†, Wanglin Zhan†, Xingxing Yang†, Chengxi Li*, Qiwei Yang, Zongbi Bao, Qilong Ren, Zhiguo Zhang*

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.6c09909