【J. Org. Chem.】南京大学俞寿云/方生和团队：假尿苷与N¹-甲基假尿苷的规模化合成

导语

核苷的结构修饰是药物设计的关键策略，主要得益于此类修饰所赋予的增强抗病毒和抗癌活性。C-核苷是一种将传统的C–N糖苷键替换为稳定的C–C键的修饰方法，使核苷具有优异的水解稳定性、改变的氢键模式以及分子识别特异性等。因此，C-核苷酸在药物研发中变得不可或缺，并在mRNA疫苗的开发中发挥着关键作用。例如，瑞德西韦用于抑制埃博拉病毒和SARS-CoV-2；天然抗生素示踪霉素、假尿嘧啶（Ψ, 1）以及N1-甲基假尿嘧啶（m1Ψ, 2）被用于RNA治疗；免疫抑制剂免疫链素-H（immucillin-H）和核苷类抗生素假尿嘧啶霉素（图1）。

图1. 代表性C-核苷类似物（图片来源：J. Org. Chem.）

Ψ是一种天然存在的C核苷酸，主要存在于tRNA和rRNA中，在体内由假尿嘧啶合成酶催化异构化形成，能够稳定RNA双螺旋结构。其衍生物m1Ψ因N甲基化而改变了氢键模式。它们的典型应用是已获批的新冠mRNA疫苗，其中关键突破在于将尿嘧啶（U）替换为m1Ψ。这种修饰不仅提高了翻译效率，还能通过避免TLR7/8的识别来降低免疫原性，从而防止mRNA被RNase L切割。因此，开发一种可靠且可扩展的生产流程以制备Ψ和m1Ψ，对于mRNA疫苗的更广泛临床应用至关重要。

核苷及其衍生物的合成包括化学法和生物合成法，其中化学合成仍是主流方法，能够高效、大规模地制备核苷单体。众多研究报道了通过将预先合成的糖基供体与核碱基偶联来合成Ψ的方法。1968年，Asbun和Binkley首次使用O-保护的核糖核内酯与锂化2,4-二苯基嘧啶成功合成了Ψ（图2）。随后，Chow、Hanessian、Shapiro、Moffatt、Brown和Lim分别使用锂化2,4-二烷氧基嘧啶作为碱基前体，合成了Ψ及其异构体α-Ψ，并采用了不同的核糖前体。然而，这些方法在工业规模化方面常常面临重大挑战。较差的非对映选择性、较低的整体产率以及严格的反应条件等限制，增加了操作复杂性和设备需求，从而阻碍了经济高效的生产。为解决这些问题，南京大学俞寿云课题组与南京方生和医药科技有限公司合作设计了用于制备Ψ和m1Ψ的新合成路线，通过系统优化，实现了公斤级制备，并建立了适用于临床应用的稳定生产工艺。相关成果发表于J. Org. Chem. (DOI：10.1021/acs.joc.6c00751)上。

图2. 从锂化2,4-二烷氧基嘧啶合成Ψ的已有报导策略（图片来源：J. Org. Chem.）

前沿科研成果

在完成成本评估后，俞寿云团队通过将糖基供体与核碱前体偶联，启动了针对Ψ和m1Ψ的第一代合成策略。具体而言，苯甲基保护的核糖内酯3用作糖基供体，而O-甲基保护的5-溴嘧啶4则作为核碱前体（图3）。偶联反应在氮气氛围下于-20℃条件下使用格氏试剂进行，得到化合物5，该化合物为两种构型的混合物，并与其羟基酮异构体处于平衡状态。优化后，经柱层析分离的化合物5产率为35%。这一结果不尽如人意，主要归因于严重的副反应，包括格氏试剂直接加到化合物5上（副产物I）、涉及核糖部分的消除途径（副产物II），以及金属化嘧啶的过度加成（副产物III）。随后，化合物5在-10℃下使用三乙基硅烷进行脱氧还原，得到化合物6。根据文献报道，还原过程首先由BF₃·OEt₂的脱氧反应生成氧阳离子中间体，两个主要中间体（³E和E₃）均在空间位阻较小的一侧被硅烷攻击，此时β构型产物占主导地位，α构型的生成则被阻断（图3）。该方法有效调控了异头碳位点的立体选择性，仅生成β构型产物。进一步将化合物6中的保护基去除，先通过在乙酸中回流化合物6与NaI反应，去除嘧啶保护基，得到化合物7。从5到7的两步反应总产率可达90%。在-78℃条件下，利用BCl₃作为路易斯酸成功裂解核糖部分上的苄基，最终得到Ψ(1)。在合成m1Ψ的过程中，作者最初的方法是将化合物7在回流条件下与碘甲烷（MeI）和N, O-双(三甲基硅基)乙酰胺（BSA）反应，生成N1-甲基化产物8,随后使用BCl₃对苯基进行低温脱保护，得到m1Ψ(2)，两步反应产率高达68%（图3）。然而，由于该路线从化合物6转化为8需要经历两个回流步骤，且条件相对苛刻，因此作者随后探索了一种更温和的甲基化策略。将化合物6在60℃下与碘甲烷反应，可使嘧啶环发生可逆甲基化，生成热力学上更稳定的中间体9。经简单减压浓缩后，在60℃下与甲醇和乙酸氯原位生成的HCl反应，可以去除O-甲基基团，从而实现碱基环的预期编辑。优化后的方案使化合物8在5至8的三步反应中产率为78%，反应时间显著缩短，更易于实现放大生产。第一代工艺实现了克级规模的制备，以核糖内酯3和尿嘧啶溴化物4为起始原料，经过四步反应总产率可达19%，获得Ψ(1)；经过五步反应总产率可达21%，获得m1Ψ(2)。

图3. 一代路线：Ψ和m1Ψ的克级规模合成（图片来源：J. Org. Chem.）

在成功建立第一代实验室规模合成路线后，方生和团队进一步研究了公斤级工业放大条件。第一代路线存在若干关键问题：1）第一步中糖基与核碱基之间的偶联产率偏低，显著提高了生产成本；2）整个合成路线需经过多次柱层析纯化，以去除特定工艺相关的杂质。通过系统探索和优化公斤级工艺，作者开发出第二代合成路线（图4）。为解决初始步骤中糖前体与核碱基之间偶联效率低的问题，作者用更具成本效益的正丁基锂取代了原有的试剂，用于锂-卤素交换反应。经过条件优化后，在−78℃条件下，化合物5实现了65%的公斤级收率，表明转化效率显著提高且成本降低。从化合物6转化为Ψ(1)的第一代工艺流程为先脱甲基，再脱乙酰化。然而，该步骤在放大后通过柱层析纯化时表现出困难。第二代工艺将顺序反转：首先进行脱乙酰化生成化合物10，随后使用NaI进行脱甲基化，从而得到Ψ(1)，整个过程共四步，总产率达28%（0.33 kg，HPLC纯度>99%）。总而言之，改进后的工艺无需柱层析，实现了缩短工艺流程。此外，新步骤中由BCl₃介导的脱乙酰化反应温度可提高至-15℃。这些优化使这两个步骤的材料成本降低了约30%。同时，化合物10作为制备Ψ(1)和m1Ψ(2)的共同中间体，确保了工艺的连续性，并有助于成本控制。

图4.二代路线：Ψ和m1Ψ的公斤级规模合成（图片来源：J. Org. Chem.）

合成m1Ψ(2)时，以上述化合物10为起始原料（图4）。在第一代路线中，苯基保护基一直保留至最终脱保护步骤。然而，大规模实验表明，在BCl₃产生的酸性条件下，产物稳定性差，且存在多种特定杂质难以去除，从而影响纯化效果。因此，第二代策略采用先进行脱苯基化，再重新引入乙酰保护基的方法，使最终脱保护可在更稳定的碱性条件下完成。具体而言，使用乙酸酐对化合物10进行乙酰保护，得到化合物11。随后，通过加热并使用BSA和甲基碘（MeI）进行甲基化反应，生成化合物12。最后，用氨水与乙酰基发生氨基解反应，得到m1Ψ(2)。尽管改进后的路线增加了额外的合成步骤，但省去了柱层析的步骤。此外，从化合物6到m1Ψ(2)可简化为四步串联过程，总产率可达33%（0.19 kg，HPLC纯度>99%），该路线总体合计六步。这种改进减少了下游加工和纯化步骤，缩短了整体工艺周期时间，并降低了人工和时间成本，从而更符合过程化学的原则。

作为代表性的C-核苷酸，Ψ和m1Ψ可提高mRNA的翻译效率，同时降低免疫原性。因此，开发出高效稳定的合成方法对于推动mRNA疫苗的研究与应用具有重要意义。本研究中，南京大学俞寿云和方生和团队建立了两代用于合成Ψ和m1Ψ的工艺路线。第一代路线通过实验室规模的方案实现了两种核苷酸的克级合成。针对公斤级扩增所面临的限制与挑战，第二代路线优化了操作步骤，使流程更加顺畅，并实现了更精细、可扩展的公斤级生产工艺。这一先进的合成策略为未来mRNA疫苗的研发与推广提供了巨大潜力。南京大学博士生焦毅为该文的第一作者，南京大学俞寿云教授（实验室合成）和南京大学/南京方生和医药科技有限公司的周步高（规模化制备）为该文的共同通讯作者。

课题组简介

俞寿云，教授，博士生导师，江苏省教学名师，化学学院副院长。2001年毕业于南京大学化学化工学院，获得学士学位。同年进入中科院上海有机化学研究所攻读博士，师从马大为研究员，2006年6月获得博士学位，并留所任助理研究员。2007年10月至2010年4月，在宾夕法尼亚大学Jeffrey Bode教授小组进行博士后研究。2010年9月，被聘为南京大学化学化工学院副教授，课题组长。2012年增选为博士生导师，2015年底晋升为教授。主要开展不对称光化学合成和激发态过渡金属不对称催化的研究。担任江苏省化学化工学会第十三届理事会理事、有机化学专业专委会副主任委员、化学奥林匹克竞赛工作委员会、南京大学第十三届教学委员会委员、《大学化学》编委、《有机化学》青年编委。曾获得宝钢优秀教师奖（2022）、江苏省教育成果奖二等奖（2021，排名第二）和Thieme Chemistry Journals Award （2012）等奖励。

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