《食品科学》：中国计量科学研究院隋志伟研究员、刘思渊副研究员等：流式分析技术快速精准检测酸奶中嗜热链球菌活菌

嗜热链球菌是一种革兰氏阳性菌，属于链球菌属，其形态学特征表现为典型的圆形或椭圆形细胞，常以成对或链状形式存在。在乳制品发酵工业中，嗜热链球菌因其安全性和在酸奶生产过程中的关键作用被国际公认为核心发酵剂。在酸奶的制备过程中，嗜热链球菌具备快速产酸的能力，能够高效分解牛乳中的乳糖，促使牛乳酸化，为后续发酵步骤创造了适宜的酸性环境，奠定了酸奶独特酸味的基础。该菌分泌蛋白酶水解酪蛋白，释放出丰富的风味前体物质。其次，嗜热链球菌能够合成胞外多糖，可显著增加酸奶黏度，赋予酸奶细腻、浓稠的质地，同时能够有效抑制后酸化现象的发生，保证了酸奶在贮藏期间的品质稳定。而且嗜热链球菌产生的丙酮酸、甲酸、叶酸和长链脂肪酸等物质可创造有利于其他乳酸菌生长的微生态环境，这种独特的“代谢协同效应”使其成为多菌种复合发酵体系中的关键菌株，能显著提升酸奶发酵的效率。综上所述，活性嗜热链球菌凭借其在产酸、风味形成、质地改善以及促进菌种协同等多方面的卓越表现，在酸奶发酵过程中具有不可替代的重要性。

嗜热链球菌的活菌数作为关键质量参数，贯穿酸奶发酵全过程并具有多维调控作用。研究表明，发酵前的嗜热链球菌接种比例显著调节发酵过程中的产酸速率、酸奶体系的黏度和保水能力，同时直接关联后酸化程度、特征风味物质合成及发酵终点判定。发酵过程中活菌群的动态变化本质上是微生物对食物微环境理化参数改变的应激响应，其种群消长规律可直观反映菌群代谢活性与适应状态。通过实时监测活菌数动态曲线，能够建立发酵参数优化模型，为工艺调控提供量化依据。根据GB 19302—2025《发酵乳》规定，成品酸奶中嗜热链球菌活菌数需超过106 CFU/mL，该指标不仅是产品质量的核心评价参数，更是预测货架期稳定性的重要生物学指标。因此，定量酸奶中活嗜热链球菌在酸奶发酵的整个阶段都具有重要的作用。

传统平板计数法作为嗜热链球菌活菌数检测的金标准，存在特异性不足、检测周期长等固有局限性。近年来，随着分子生物学技术的发展，聚合酶链式反应（PCR）、叠氮溴化丙锭（PMA）-PCR联用技术、实时PCR（real-time PCR）以及荧光定量环介导等温扩增（LAMP）等新兴方法相继应用于嗜热链球菌的检测，显著缩短了检测时间。然而，这些方法仍面临检测精度受限、依赖标准曲线定量、需核酸提取步骤以及多种引物和探针设计需求等技术瓶颈。针对酸奶这一特殊基质，开发兼具快速性和准确定量能力的活性嗜热链球菌检测方法仍属行业迫切需求。

流式细胞术（FCM）与荧光标记技术的联用已成为活菌定量的可靠手段，国际标准化组织（ISO）已将其列为乳制品益生菌计数的标准方法，但该方法存在无法进行菌种鉴定的局限性。研究表明，通过引入荧光标记抗体或物种特异性寡核苷酸探针，可实现乳酸菌的精准分类检测。其中关于嗜热链球菌特异性抗体尚未成功制备，但其16S rRNA寡核苷酸探针已展现出显著的菌株鉴别潜力。这使得FCM与分子探针联用技术成为定量酸奶中活性嗜热链球菌的前沿解决方案。

中国计量科学研究院前沿计量科学中心的蔡小雨、刘思渊*、隋志伟*等人开发一种基于FCM的嗜热链球菌活菌检测方法，通过整合PMA的活细胞识别功能与16S rRNA新型寡核苷酸探针（NOP）的特异性识别能力，建立PMA-NOP-FCM协同检测系统。该方法旨在应用于市售酸奶及自制发酵酸奶样品中嗜热链球菌活菌的定量分析，以验证其检测可靠性。同时评估该技术在不同发酵条件下生产的各类酸奶产品中的定量检测性能，以期为发酵过程监控和酸奶质量控制提供有效的技术手段。

1 PMA-NOP-FCM法计数酸奶中嗜热链球菌活菌的原理及可行性分析

酸奶中含有乳脂球和蛋白质等大分子，这些大分子会干扰基于FCM的检测。因此，本研究对酸奶样品进行前处理，以获得不含大分子物质的菌悬浮液。PMA选择性检测活菌，因为它只穿透受损细胞膜，与死亡细胞的核酸共价结合，通过FCM的488RFL通道显示RFL，表示死亡细菌。残留的细胞外PMA通过卤素灯照射灭活，确保不干扰后续的NOP杂交。在细菌鉴定方面，选择嗜热链球菌的16S rRNA基因高变区作为相应NOP的靶序列。通过固定、荧光探针杂交和洗涤，确保16S rRNA靶向NOP快速进入菌体并高效、高特异性结合。随后，通过FCM分析NOP标记的嗜热链球菌。不同的点图显示不同的细菌群体，在488 nm激发光的作用下，嗜热链球菌活菌显示NOP的GFL，而死细胞显示PMA衍生的RFL，非目标颗粒或细菌只显示了无荧光的信号（图1）。为了进一步验证PMA、NOP与菌体的结合状态，利用荧光显微镜进一步分析NOP-FCM方法的检测效果，如图2所示，活性嗜热链球菌只显示NOP的GFL，死菌显示GFL和RFL。

2 PMA-NOP-FCM法特异性分析

为系统评价PMA-NOP-FCM法的物种特异性，本研究选取44 株代表性菌株进行验证，具体菌种信息详见表1。如图3所示，嗜热链球菌与其近缘种（唾液链球菌）、代表性乳杆菌、代表性双歧杆菌及代表性病原菌株的检测结果存在显著差异。仅嗜热链球菌呈现NOP探针标记的GFL信号群与未标记背景的完全分离，而其余菌株均未观察到信号分离现象（图3A）。同时结合表1中特异性结合的数据，所有目标菌株均被NOP探针有效标记，非目标菌株均无交叉反应。共同证明PMA-NOP-FCM法的优异特异性。

3 NOP结合嗜热链球菌条件的优化

NOP杂交的成功取决于各种关键参数，包括杂交温度、探针质量浓度和杂交时间。为了获得最优的目标RNA杂交，通过控制变量进行优化。通过最大化目标菌株的荧光信号确定最佳温度和探针数量，将嗜热链球菌的完全结合效率（100%）作为杂交时间的判定标准。1）在不同的杂交温度（40、42、44、46、48、50 ℃和52 ℃）条件下，利用浓度为108 cells/g菌悬液确定最佳温度。值得注意的是，观察到一种温度依赖性杂交模式，确定46 ℃为杂交的最佳温度（图4A）。2）利用相同浓度的菌悬液确定最优探针质量浓度，发现荧光信号强度与探针质量浓度呈显著相关。在优化探针质量浓度梯度（4、5、6、7、8 ng/μL和9 ng/μL）时，发现最优探针质量浓度为7 ng/μL（图4B）。3）充分的杂交时间是保证其特异性结合的必要条件，系统评价不同杂交时间（15、30、45、60、90、120、150 min和180 min）对荧光信号强度的影响。值得注意的是，在反应时间90 min时，NOP就表现出100%的完全杂交的效果（图4C）。

最终优化后，反应体系设置为：NOP质量浓度7 ng/μL；杂交温度46 ℃；杂交时间90 min，以便通过PMA-NOP-FCM准确、快速地定量分析活性嗜热链球菌。

4 活菌识别与检测稳定性能力分析

为系统评估PMA-NOP-FCM法对嗜热链球菌活菌的识别效能，本研究设计了梯度混合实验，通过将嗜热链球菌的死菌与活菌按不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9和0∶10）进行混合，采用该方法进行定量分析。流式分析技术检测结果显示（图5A～K），RFL信号代表死菌，GFL信号对应活菌，不同比例的混合样本均呈现清晰的荧光分布特征。进一步将PMA-NOP-FCM法检测获得的活菌与死菌比例与理论混合比例进行比对（图5L），两者表现出高度的一致性。这一结果充分证实了PMA-NOP-FCM法在嗜热链球菌活菌识别中具有卓越的区分能力。

进一步通过重复性实验验证，在5 个具有相同活死菌比例的平行样品中，每个样品测定3 次，结果显示该方法对活菌定量的相对标准偏差（RSD）为4.68%（图6A），表明其具备良好的检测稳定性。

5 PMA-NOP-FCM法与平板计数法对比

本研究采用平板倾注法与PMA-NOP-FCM法对嗜热链球菌进行梯度定量分析（104～108 cells/g），系统评估了所建立PMA-NOP-FCM检测方法的动态范围。实验结果表明（图6B），两种方法在全部测试浓度范围内呈现高度线性相关（R2＝0.998 4），证明PMA-NOP-FCM法具有可靠的定量一致性。

用PMA-NOP-FCM法对德氏乳杆菌保加利亚亚种单独发酵的酸奶（即为嗜热链球菌空白样品）进行检测，结果显示有8.3×103 cells/g的背景信号（图6C）。因此，采用空白样品结果的3 倍和10 倍计算方法的检测限和定量限，分别为2.5×104 cells/g和8.3×104 cells/g。该方法具有较高的定量限，然而，这一定量限并不影响其在酸奶中的应用，因为酸奶中需要满足至少106 cells/g活菌的标准。

6 预处理方法与回收率验证

利用光学显微镜，对添加嗜热链球菌的由单独德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵的酸奶样品进行前后对比，图7A是仅由德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵酸奶的显微镜图像，图7B是向仅由德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵酸奶中添加定量嗜热链球菌的显微镜图像，预处理后的含嗜热链球菌样品（图7C）呈现出更清晰的微生物结构，表明预处理工艺能有效减少样品中的干扰杂质。为评估方法前处理流程对嗜热链球菌活性的影响，采用相同前处理步骤，对嗜热链球菌活菌悬液进行处理。使用PMA-NOP-FCM法对处理前后的菌液进行分析，结果显示活菌数分别为（5.73±0.19）×107 CFU/mL 与（5.64±0.18）×107 CFU/mL，差异不显著（P＞0.05）（图7D）。说明前处理操作不会对嗜热链球菌的活菌数造成影响。为定量评估预处理效果，采用梯度稀释法配制不同活菌浓度的菌悬液，经标准化预处理流程后，通过PMA-NOP-FCM联用技术精确测定活菌数量。实验数据显示（表2），所有浓度梯度的嗜热链球菌回收率（91.61%～106.17%）均达到实验预设标准，证实该预处理方法在保持菌体活性的同时具备良好的回收稳定性。

7 酸奶实际样品检测结果

为系统评估PMA-NOP-FCM方法在定量市售酸奶活性嗜热链球菌中的检测性能，采用该方法与传统的倾注平板法对10 个商业酸奶样品进行了平行检测。实验结果表明，两种检测方法数据间无显著差异（P＞0.05），证实了PMA-NOP-FCM方法的准确性（表3）。值得注意的是，PMA-NOP-FCM在各样品检测中表现出更优越的稳定性，其RSD显著低于倾注平板法，这凸显了该技术在重复性方面的优势。定量分析结果显示检测的10 种市售酸奶样品中活菌数均超过106 CFU/g（图8），符合国标对酸奶产品的质量标准。综合来看，这些数据充分证明了PMA-NOP-FCM作为一种快速、稳定且可靠的检测方法，在酸奶产品质量控制与活性菌株定量分析中具有重要的应用价值。

8 PMA-NOP-FCM法的优势与局限性

PMA-NOP-FCM法的总检测时间约为2 h，包括样品预处理（10 min）、PMA染色（10 min）、NOP杂交（90 min）和流式细胞分析（10 min）。相较于传统平板计数法（48～72 h），该方法显著缩短了检测时间，且测量重复性较好（RSD＝4.68%），说明该方法具有快速和精准检测活菌数的特点。与新型的快速检测方法（如分子生物学方法）相比，该方法具备能够检测活菌的优势，且耗时相对较短（表4）。

此外，PMA-NOP-FCM法无需核酸提取、无需采用标准曲线定量，在精准性上具有明显优势。目前，流式细胞仪的高成本及操作复杂性可能限制其在资源有限地区的推广，但随着技术进步与设备成本降低，PMA-NOP-FCM法在食品微生物快检领域具有广阔的应用前景。

结 论

本研究成功开发了一种基于PMA-NOP-FCM联用技术的活性嗜热链球菌快速检测方法。通过系统优化，确立NOP杂交过程中最佳反应条件为NOP探针质量浓度7 ng/μL、在46 ℃杂交温度条件下杂交90 min。PMA-NOP-FCM法在实现对嗜热链球菌特异性识别的同时精准定量活菌数，从酸奶样品前处理至流式分析整个检测流程仅需2 h，与传统方法相比检测效率显著提升。该方法表现出卓越的分析性能，检测重复性良好（RSD＜5%），与平板计数法呈现高度线性相关性（R2＝0.998 4），该方法能够精准测定嗜热链球菌中104～108 cells/g范围内的活菌含量。实际应用验证表明，对于加标酸奶样品中的回收率稳定在91.61%～106.17%之间，进一步在市售酸奶中进行检测也具有准确且稳定的检测效果，为酸奶质量控制提供了可靠的技术手段。本研究建立的PMA-NOP-FCM检测体系兼具快速与准确优势，在乳制品生产过程的实时监控和产品质量监管方面展现出重要的应用价值。

作者简介

通信作者：

隋志伟，博士，研究员，中国计量科学研究院科技管理部副主任，国家计量标准一级考评员，主要从事微生物计量研究。

先后担任国际计量局化学和生物计量咨询委员会(CCQM)微生物特别工作组(MBSG)委员、亚太计量规划组织物质的量技术委员会(TCQM)委员、全国标准物质计量技术委员会委员、中国疫苗行业协会标准化工作委员会委员、全国生物气溶胶标准化技术工作组委员等社会职务。主持国家重点研发计划项目等10多项,获国家科技进步二等奖等科技奖励,组织和参与国际国内比对5 项,研制国家标准物质40余种,发表Signal Transduction and Targeted Therapy、Journal of Infection、Analytical Chemistry、Journal of Dairy Science等国内外期刊论文90余篇,授权发明专利11 件,制定国家标准和计量技术规范15 项。

通信作者：

刘思渊，博士，工程师。中国计量科学研究院生物安全二级实验室技术负责人，主要从事微生物计量与标准研究。

主持和参与国家重点研发计划项目等13项，获厅局级科技奖励一项。国家市场监督管理总局本级食品安全承检机构考核办公室成员，负责全国50余家机构的微生物检测能力评价22 项。组织和参与微生物国际国内计量比对3 项，开展全国微生物能力验证8 项。制定国家计量技术规范9 项，获批微生物国家有证标准物质35 种。授权发明专利4 项。以第一/通信（含共同）作者发表论文21 篇，其中中科院SCI一区TOP论文10 篇。

第一作者：

蔡小雨，中国计量科学研究院研究生。目前是一名在河北农业大学和中国计量科学研究院（联合培养）攻读生物与医药专业的研究生，主要研究方向为食品微生物计量与分子生物学。本科和研究生期间多次获得一等奖学金、国家奖学金与“优秀研究生”称号，参与发表多篇中英文文章。

引文格式：

蔡小雨, 代森迪, 丁文龙, 等. 流式分析技术快速精准检测酸奶中嗜热链球菌活菌[J]. 食品科学, 2026, 47(7): 109-118. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250926-210.

CAI Xiaoyu, DAI Sendi, DING Wenlong, et al. Rapid and quantitative detection of viable Streptococcus thermophilus in yoghurt based on flow cytometry technology[J]. Food Science, 2026, 47(7): 109-118. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250926-210.

实习编辑：王雨婷；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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