《自然·通讯》苏州大学附属第一医院：ROS/MMP13双响应有机二硒键透明质酸水凝胶微球！

水凝胶微球（Hydrogel Microparticles）作为关节腔注射载体，在骨关节炎（OA）局部治疗中展现出巨大潜力。然而，传统硒纳米粒子（SeNPs）虽然具备抗氧化能力，但治疗窗口窄、体内代谢安全性不明确，且难以实现对关节微环境中ROS和MMP13等病理因素的智能响应。

苏州大学附属第一医院骨科、骨科研究所联合化学学院PCFM实验室的跨学科团队在 Nature Communications发表研究，开发了一种ROS/MMP13双响应有机二硒键水凝胶微球（HSPHR）。该微球以透明质酸（HA）为骨架，通过硫烯点击化学接枝硒代半胱氨酸形成二硒键（Se-Se），同时引入MMP13响应短肽（MRP, KCGPQG），利用微流控技术制备出100-120 μm的均一微球。

HSPHR在OA病理微环境中智能响应ROS和MMP13，实现有机硒的定点释放，通过TXNRD1介导的PI3K-AKT-mTOR通路恢复线粒体功能，同步治疗软骨退化、滑膜炎症和软骨下骨硬化三大OA病理改变。

原文 Figure 7：HSPHR微球制备示意图。双响应设计将有机硒递送至软骨、滑膜、软骨下骨三大关节组织，实现骨关节炎多模态治疗。

核心亮点

ROS/MMP13双响应设计：Se-Se键响应ROS氧化断裂释放有机硒，MMP13切割MRP肽段加速降解——双重响应形成"环境信号→结构解离"的反馈回路

有机硒替代纳米硒：硒代半胱氨酸以共价键接枝到HA骨架上，比传统SeNPs抗氧化能力更强，关节腔驻留时间更长（≥2周），且避免纳米粒子长期安全性隐患

TXNRD1→PI3K-AKT-mTOR通路：有机硒上调TXNRD1表达，通过破坏Trx1-PTEN相互作用激活下游通路，恢复线粒体OXPHOS——这一机制在软骨细胞、破骨细胞、巨噬细胞中均被验证

三组织多模态治疗：软骨（COL2↑/MMP13↓）+ 滑膜（M1→M2极化）+ 软骨下骨（抑制破骨活化）——一个微球系统覆盖OA全病理链

微流控均一制备：三通接头+UV光交联，粒径100-120 μm均一可控，冻干造孔后形成疏松多孔结构

团队和期刊信息


 • 标题：Organic di-selenide hydrogel microspheres for multimodal treatment of osteoarthritis
• 期刊：Nature Communications (2026), 17: 2300
• DOI：10.1038/s41467-026-68817-2
• 团队：苏州大学附属第一医院骨科、骨科研究所；苏州大学化学学院PCFM实验室；复旦大学华山医院运动医学科
• 通讯作者：Yong Xu（yuxu1615@suda.edu.cn）、Xuesong Zhu（zhuxs@suda.edu.cn）、Huilin Yang（suzhouspine@163.com）
• 共同第一作者：Yang Liu、Yijian Zhang、Chenqi Yu、Xiaowei Xia（并列一作）
• 许可：CC BY 4.0 (Open Access)
• 资助：国家自然科学基金（82272494、82472452、82402864、82302664、82572842）、国家重点研发计划（2022YFC2502902）、江苏省卫健委重点项目（K2023079）、江苏省自然科学基金（BK20240368、BK20230494）、中国博士后科学基金（2024M762313）、Boxi青年自然科学基金（BXQN2023014）、顾苏创新创业领军人才项目（ZXL2023204）等

研究起点

01

硒蛋白缺失是OA软骨退化的关键驱动

团队首先从临床样本入手，分析了6例OA患者和正常对照的膝关节软骨组织。

PCR结果显示：人软骨细胞中表达Gpx1、Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3、Sellnow、Sellnot、Msrb1等硒蛋白基因，其中Gpx1和Txnrd1在正常和OA软骨间的表达差异最为显著。

蛋白水平验证（Western Blot）：正常软骨中GPX1和TXNRD1蛋白水平显著高于OA软骨。

免疫荧光分析：正常软骨细胞中GPX1和TXNRD1蛋白水平显著高于OA软骨细胞，且与OA病理标志物COL2呈正相关、与MMP13呈负相关。

免疫组化验证（人类+大鼠DMM模型）：

• 人类OA损伤区域：软骨基质大量丢失，GPX1和TXNRD1表达显著下降

• 14周龄DMM大鼠：呈现与人类OA一致的趋势

核心结论：OA软骨细胞中硒蛋白（尤其是抗氧化蛋白GPX1和TXNRD1）显著减少，导致细胞氧化还原失衡，这是OA进展的关键驱动因素之一。

对照基础

02

硒纳米粒子（SeNPs）恢复硒蛋白合成

在开发微球之前，团队先验证了传统SeNPs作为对照基础的有效性。

SeNPs表征：

参数

数值

粒径（TEM）

~250 nm

粒径（DLS）

~250 nm（与TEM一致）

Zeta电位

−11.7 mV

表面元素

EDX确认Se均匀分布

生物安全性：20 ng/mL和50 ng/mL浓度的SeNPs处理大鼠软骨细胞，Live/dead染色显示细胞存活率 >97%。

体外效果（IL-1β诱导的炎症软骨细胞）：

• SeNPs上调软骨合成相关基因，下调降解相关基因

• 呈浓度依赖性上调Gpx1、Txnrd1、Sephs1基因表达

• 免疫荧光证实：IL-1β处理后硒蛋白显著下调，SeNPs处理逆转该趋势，恢复软骨基质代谢

• Western Blot：磷酸化硒蛋白合酶（p-SEPHS1）表达增加，下游GPX1和TXNRD1呈剂量依赖性上调

体内验证（DMM大鼠关节腔注射SeNPs）：

• Micro-CT：SeNPs治疗组胫骨区软骨下骨小梁数量增加、体积增大

• 骨小梁参数（BV/TV、Tb/Th、Tb/Sp）改善

• S.O.染色：关节面不规则度改善，浅层软骨增厚，OARSI评分降低

• COL2恢复正常，MMP13显著下调

• GPX1和TXNRD1阳性细胞数增加

• 开放场实验：50 ng/mL SeNPs改善DMM小鼠运动意愿和步态

原文 Figure 2：SeNPs TEM图、EDX能谱、粒径分布、Zeta电位、Live/dead染色、炎症软骨细胞免疫荧光（MMP13/COL2/ROS）、硒蛋白相关基因热图、Western Blot定量

SeNPs的局限性（论文原文指出）：尽管SeNPs在椎间盘退变等研究中展现了疗效，但其长期安全性和生物代谢存在限制——治疗窗口窄、精确毒性阈值不明确，限制了临床应用。这成为团队开发有机硒微球的直接动机。

03

HSPHR微球制备与ROS/MMP13双响应释放

材料合成路线：

第一步：HA-Se-Se水凝胶（HS）合成

1. HA溶解于水→超声30 min→稀盐酸透析4 h（酸化）

2. 酸化HA溶解于DMSO → 加入EDC/NHS活化 → 反应6 h

3. 加入硒代半胱氨酸（selenocystamine）和MMP13响应肽（MRP, KCGPQG），质量比 硒代半胱氨酸:HA:短肽 = 2:2:1

4. 超声30 min → 反应12 h → 形成二硒键

5. 透析（去除DMSO）→ 冻干48 h → 获得含二硒键的HA单体

第二步：HAMA合成

1. 4 mL甲基丙烯酸酐（MA）缓慢加入100 mL 2wt.% HA溶液

2. 5M NaOH逐滴加入至4 mL（微量注射泵控制）

3. 冰浴条件下反应过夜

4. 透析3天（截留分子量3500 Da）→ 冻干 → -20°C保存

第三步：微流控制备HSPHR微球

参数

数值

分散相（水相）

HAMA + HSP + RGD-MA，质量比 5:5:1

连续相（油相）

载体油

水相流速

15（相对单位）

油相流速

500（相对单位）

水:油流速比

15:500

交联方式

UV紫外光固化

后处理

75%乙醇反复洗涤→PBS浸泡（×3次，每次4h）

造孔

-80°C冷冻4 h → 冻干48 h

微球表征数据：

参数

数值/结果

粒径

100-120 μm（均一）

形态

球形，表面多孔疏松

77Se NMR

Se-Se峰 290.23 ppm

Raman光谱

Se-Se金属振动峰 254 cm⁻¹

FTIR

NH伸缩振动 3287 cm⁻¹；Se-Se特征峰确认

XPS

检测到Se特征峰

冻干后孔径

小于单相HAMA（SEM确认）

双响应释放特性：

条件

降解行为

硒释放行为

H₂O₂（0.1%）

加速降解（ROS氧化断裂Se-Se键）

前24h显著增强

MMP13（5 U/mL）

加速降解（切割MRP肽段）

前24h显著增强

H₂O₂ + MMP13 联合

降解进一步加速（双响应协同）

释放效率最高

体内驻留：Cy5.5标记的HSPHR微球注射到大鼠关节腔内，正常大鼠和OA大鼠均实现了持续2周以上的荧光信号，证实微球在关节腔内的长效驻留和环境响应性释放性能。部分吸收的纳米粒子通过肝脏代谢。

抗氧化能力对比：HSPHR的抗氧化效果优于50 ng/mL SeNPs（DPPH、ABTS、•OH三种自由基清除实验均证实）。

原文 Figure 3：HSPHR制备流程示意图、77Se NMR、SEM形貌对比（HAMA vs HSPHR）、Raman/FTIR/XPS光谱、响应性释放/降解曲线、体内荧光成像（2周驻留）、抗氧化能力对比。

恢复线粒体功能

04

TXNRD1介导PI3K-AKT-mTOR通路

这是本研究的机制核心。

RNA测序发现（软骨细胞）：

• HSPHR处理后识别出343个差异表达基因（DEGs），114个上调，229个下调

• GO和KEGG富集分析：软骨基质代谢改变，PI3K-AKT信号通路显著富集

• 蛋白质组学进一步确认TXNRD1和GPX1蛋白表达上调

• GSEA分析：糖酵解相关基因显著富集

TXNRD1的关键角色验证：

• TXNRD1过表达 → 显著增强IL-1β条件下的软骨形成效率

• TXNRD1沉默（siRNA）→ 严重损害软骨形成进程

• 机制解释：TXNRD1过表达促进OA软骨细胞中ROS的清除

下游信号验证（使用TXNRD1抑制剂TRi-1，12 nM）：

条件

TXNRD1

P-PI3K

P-AKT

P-mTOR

Ctrl

正常

正常

正常

正常

IL-1β

IL-1β + HSPHR

↑↑ 恢复

↑↑ 恢复

↑↑ 恢复

↑↑ 恢复

IL-1β + HSPHR + TRi-1

↓↓ 抑制

↓↓ 抑制

↓↓ 抑制

↓↓ 抑制

线粒体功能恢复：

指标

IL-1β组

HSPHR组

HSPHR+TRi-1组

ATP5A

恢复至正常

MT-ND4

恢复至正常

COX 4

恢复至正常

TOMM20

恢复至正常

线粒体膜电位（MMP）

恢复

TEM线粒体形态

肿胀、嵴消失

恢复正常

恢复被阻断

Seahorse细胞外流量分析（能量代谢重编程）：

指标

IL-1β vs Ctrl

HSPHR vs IL-1β

HSPHR+LY294002

ECAR（糖酵解）

↑↑ 增强

↓↓ 逐步下降

↑↑ 代偿性升高

糖酵解储备

↑↑ 加速线粒体损伤

OCR（基础呼吸）

ATP产生

最大呼吸能力

核心结论：HSPHR incubation诱导炎症软骨细胞发生能量代谢重编程——从糖酵解为主转换为氧化磷酸化（OXPHOS）为主，这一转变与PI3K-AKT-mTOR通路激活直接相关。

抑制剂/激活剂验证（PI3K通路）：

• LY294002（PI3K磷酸化抑制剂，0.5 μM）：逆转HSPHR的所有保护效果

• 740Y-P（PI3K磷酸化激活剂，3 μM）：效果与HSPHR相当

重要发现：HSPHR对PI3K的激活能力与740Y-P相当，说明该生物材料可以替代小分子化学药物，减少药物代谢相关的毒性。

抗氧化效果：HSPHR处理增强了细胞对O₂⁻、•OH等过量自由基的清除能力。

原文 Figure 4：PI3K/AKT/mTOR WB条带、线粒体蛋白WB、TEM线粒体形态、JC-1染色、TOMM20/ATP5A/COX IV/MT-ND4免疫荧光、ECAR实时曲线、OCR实时曲线、三种自由基清除效率。

M1→M2极化

05

破骨细胞抑制与巨噬细胞

破骨细胞（RAW264.7，RANKL 50 ng/mL诱导）：

HSPHR处理效果：

• 有效抑制破骨细胞活性和进一步融合

• 破骨相关标志物CTSK、MMP9、CD40L显著降低

体内验证（DMM大鼠术后2周）：

• DMM组：破骨细胞过度活化

• HSPHR治疗组：有效抑制破骨活化，恢复骨密度

破骨细胞RNA测序：

• 识别出3202个DEGs

• Pik3cg基因显著上调 → 提示PI3K-AKT-mTOR通路激活

• KEGG和GSEA富集分析：PI3K-AKT通路为核心

通路验证（破骨细胞中）：

• 740Y-P激活通路 → 抑制破骨活化

• LY294002抑制通路 → 促进破骨活化

• 证实PI3K-AKT-mTOR通路在破骨细胞中的调控作用

滑膜巨噬细胞极化：

流式细胞术（FCA）结果：HSPHR处理后巨噬细胞从M1表型向M2表型显著转变。

免疫荧光共染色进一步确认了极化转变。

巨噬细胞转录组测序：HSPHR处理的M1巨噬细胞中PI3K-AKT通路同样显著富集。

通路验证（巨噬细胞中）：

• LY294002抑制通路 → 加剧炎症状态

• 740Y-P激活通路 → 促进抗炎分化

DMM模型滑膜炎症评估：

• HSPHR治疗显著降低滑膜炎症

• iNOS下调、IL-10分泌增加

• 与滑膜组织中硒蛋白上调相关

原文 Figure 5：HSPHR处理破骨细胞的火山图、KEGG通路富集、GSEA图、Trap染色、破骨标志物WB定量、PI3K/AKT/mTOR WB。

DMM模型

06

全周期治疗 + 软骨缺损修复

DMM模型（早期OA全周期治疗，8周）：

实验流程：SD大鼠DMM术后1周开始关节腔注射治疗，8周后取材分析。

指标

生理盐水组

HR微球组

HSPHR组

软骨退化

严重侵蚀破坏

部分恢复糖胺聚糖

显著改善

COL2

部分恢复

MMP13

GPX1/TXNRD1

PI3K-AKT通路

抑制

激活

线粒体自噬

诱导

全层软骨缺损模型（晚期软骨再生）：

模型参数：SD大鼠股骨滑车沟，电钻制备直径1.5 mm、深度1.5 mm的全层软骨缺损。

治疗方案：HSPHR负载软骨源性祖细胞（CPCs），关节腔注射。

时间点

生理盐水组

HSPHR组

4周

再生有限，有空腔和不规则边缘

加速软骨形成

8周

无胶原再生（ECM组分缺失）

恢复天然透明软骨样ECM

COL1（纤维软骨标志）表达

COL2↑ COL1↓

运动功能恢复（DMM小鼠HSPHR治疗）：

• 相对活动水平、活动时间、活动距离、平均速度：均显著改善

• 步态分析：步幅和步长改善，前后足印尺寸缩小

软骨下骨保护（Micro-CT）：HSPHR有效防止DMM术后软骨下骨硬化发展。

原文 Figure 6：DMM模型治疗流程、S.O./甲苯胺蓝/HE染色、COL2/MMP13/TXNRD1/GPX1免疫组化、p-mTOR/p-AKT免疫荧光。

体内安全性

系统性安全性评价：

评价指标

结果

主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）

HE染色无显著异常

血液生化参数（TP、ALB、AST、ALT、ALP、BUN、Cre）

无异常

胃肠组织（胃、小肠、结肠）

无明显炎症

证实HSPHR系统具有优异的生物相容性。

总结

该研究首次开发了基于有机二硒键的ROS/MMP13双响应水凝胶微球（HSPHR），通过透明质酸骨架接枝硒代半胱氨酸+MMP13响应肽，利用微流控技术制备100-120 μm均一微球。

HSPHR在OA病理微环境中智能响应ROS和MMP13，释放有机硒，通过TXNRD1介导的PI3K-AKT-mTOR通路恢复线粒体OXPHOS，实现软骨（COL2↑/MMP13↓/线粒体功能恢复）、滑膜（M1→M2极化转换）和软骨下骨（抑制破骨活化）的三组织多模态治疗。

在DMM模型中延缓OA全病程进展，在软骨缺损模型中促进透明软骨再生。该工作建立了"有机硒+水凝胶微球+双响应设计"的多模态治疗新范式，为退行性关节疾病的精准治疗提供了独特思路。