FSHW | 核桃肽与人参皂苷Rg1联合治疗可预防记忆障碍小鼠模型的神经元丢失和认知能力下降

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Introduction

随着全球人均寿命的增长，神经退行性疾病的患病率大幅上升，现已成为仅次于癌症的第二大死亡原因。此外，阿尔茨海默病（AD）的患病风险也显著增加，并且它是最致命的疾病之一。神经递质的减少、胆碱能神经元的变性以及突触功能的衰退都会损害胆碱能功能，这也是导致记忆力恶化的一个重要原因。将天然产物中的活性成分与其他生物活性化合物联合使用，可能具有协同效应，能增强生物活性和利用率，并抑制认知障碍。本研究中，假设活性肽和人参皂苷Rg1能够增强记忆力。因此，通过行为学实验、脑部病理切片和高尔基染色，研究了核桃肽和人参皂苷Rg1联合给药是否可用于治疗东莨菪碱诱导的小鼠认知障碍。还进行了Western blotting检测和免疫组织化学分析，并利用PC12细胞来确定核桃肽和人参皂苷Rg1复合物调控神经介质的机制。

Results

＜3 kDa肽和Rg1对东莨菪碱处理小鼠运动及探索活动的影响

通过MWM实验来确定核桃抗氧化肽＜3 kDa、Rg1以及＜3 kDa＋Rg1对小鼠学习和记忆功能的影响（图1B）。与对照组小鼠相比，东莨菪碱处理组的小鼠逃避潜伏期更长、总运动距离更远，而有效区域运动时间和有效区域运动距离则更短（图1C–F；P＜0.01）。这些结果表明，东莨菪碱成功诱导了认知功能障碍。与对照组小鼠相比，模型组小鼠的运动轨迹呈现边缘化。而＜3 kDa组、Rg1组以及＜3 kDa＋Rg1组的小鼠则表现出更强的朝向隐藏平台所在目标象限的运动趋势（图2）。

图1 分子量＜3 kDa的组分、Rg1以及＜3 kDa＋Rg1联合用药对东莨菪碱诱导的MWM定位巡航实验小鼠的影响

图2 ＜3 kDa组分、Rg1、＜3 kDa＋Rg1对东莨菪碱诱导的MWM小鼠空间探索能力的影响

＜3 kDa和Rg1治疗对小鼠血清中单胺类递质和胆碱能神经递质的影响

东莨菪碱组小鼠血清中DA、5-HT和Glu的含量（分别为（45.67±3.63）、（66.18±3.79）和（71.83±3.46）U/mg）显著低于对照组（图3A–C；P＜0.05）。＜3 kDa、Rg1和＜3 kDa＋Rg1治疗组小鼠的DA含量显著高于对照组（图3A；P＜0.05），且＜3 kDa＋Rg1组的DA含量高于其他组。＜3 kDa＋Rg1组小鼠的5-HT含量（（125.31±2.64）U/mg）显著高于＜3 kDa组和Rg1组（分别为（114.0±2.8）和（82.58±3.69）U/mg；P＜0.05）（图3B）。与模型组小鼠相比，＜3 kDa（（129.62±2.87）U/mg）和＜3 kDa＋Rg1（（134.18±2.66）U/mg）组小鼠的Glu含量更高（图3C）。与对照组小鼠相比，东莨菪碱组小鼠的ACh、VAChT和ChAT水平（（83.21±2.83）、（60.12±2.67）和（52.23±3.07）U/mg）显著降低，而AChE活性（（86.37±3.73）U/mg）显著升高（图3D-G；P＜0.05）。＜3 kDa组、Rg1组和＜3 kDa＋Rg1组小鼠的ACh、VAChT和ChAT水平均显著高于模型组（P＜0.05），其中＜3 kDa＋Rg1组小鼠的这些水平均为所有组别中最高。＜3 kDa＋Rg1组小鼠的AChE活性（（47.7±0.99）U/mg）显著低于＜3 kDa组（（56.19±1.41）U/mg）和Rg1组（（68.69±1.82）U/mg）的小鼠。

图3 小鼠血清中神经递质含量的变化

＜3 kDa和Rg1治疗对海马神经元的影响

采用H&E染色和尼氏染色来确定神经元的损伤程度。H&E染色结果显示，对照组小鼠的海马体结构正常。齿状回（DG）区域的神经元排列整齐紧密，结构完整清晰，无细胞皱缩、深染或任何类型的变性。模型组小鼠的海马体出现结构异常，DG区域的神经元排列疏松、萎缩、变性（图4A）。组织间隙增大，并观察到细胞肿胀和深染。与模型组小鼠相比，＜3 kDa组、Rg1组和＜3 kDa＋Rg1组小鼠的海马体结构轻微异常，DG区域的神经元出现了一定程度的变性。此外，这三个组别小鼠的神经元排列、组织间隙、萎缩和深染等参数均得到显著改善。

图4 分子量＜3 kDa的组分、Rg1以及二者联用对东莨菪碱所致小鼠神经元形态的影响

＜3 kDa和Rg1治疗对海马突触的影响

通过高尔基染色（图5A）分析小鼠海马体DG区的树突棘密度。模型组小鼠的锥体神经元总长度和总数量与对照组小鼠存在差异。＜3 kDa＋Rg1组小鼠的神经元比＜3 kDa组或Rg1组的小鼠更长、更丰富。＜3 kDa＋Rg1组小鼠的顶端树突和基底树突之间差异显著。＜3 kDa＋Rg1组小鼠的锥体神经元比＜3 kDa组或Rg1组的小鼠更密集。对DG区的树突棘数量和单位长度内的树突棘数量进行了定量分析。给予东莨菪碱后，小鼠神经元的树突棘变得异常且数量减少。模型组小鼠的海马锥体细胞萎缩，顶端树突的长度和数量减少。模型组小鼠的锥体细胞顶端树突发生分叉且长度缩短（图5B）。

图5 分子量＜3 kDa组分、Rg1以及＜3 kDa组分＋Rg1对东莨菪碱所致小鼠高尔基染色的影响

＜3 kDa和Rg1治疗对海马区AChE和ChAT免疫组织化学的影响

AChE的免疫组织化学定位结果显示，与对照组小鼠相比，模型组小鼠海马DG区存在大量深染色的AChE阳性神经元（图6A）。模型组小鼠的AChE阳性区域面积（（37.47±0.89）%）、区域密度（0.04±0.01）和组织化学评分（37.48±0.01）均显著更高（图6B–D；P＜0.05）。经＜3 kDa肽、Rg1和＜3 kDa肽＋Rg1治疗后，小鼠海马DG区AChE阳性神经元的深染色程度减弱。ChAT的免疫组织化学定位结果表明，与对照组小鼠相比，模型组小鼠海马DG区仅有少量深染色的ChAT阳性神经元（图6E）。

图6 分子量＜3 kDa组分、Rg1及分子量＜3 kDa组分＋Rg1联用对海马DG区AChE和ChAT免疫组化的影响

＜3 kDa和Rg1治疗对BDNF/TrKB/CREB通路的影响

神经递质水平会影响BDNF及其相关信号通路。通过Western blotting检测了BDNF/TrKB/CREB信号通路中蛋白质的表达情况（图7A）。模型组小鼠的BDNF（0.41±0.12）、TrKB（0.44±0.05）、p-CREB/CREB（0.01±0.01）和VAChT（0.28±0.01）水平均显著低于对照组（P＜0.05）。经＜3 kDa、Rg1和＜3 kDa＋Rg1处理后，小鼠海马体中的BDNF、TrKB、p-CREB/CREB和VAChT水平均显著高于模型组（图7B；P＜0.05）。此外，＜3 kDa＋Rg1组小鼠的这些蛋白质水平均高于＜3 kDa组或Rg1组。＜3 kDa＋Rg1联合治疗改善了东莨菪碱所致的神经递质功能障碍的调节机制，并修复了小鼠胆碱能系统的损伤（图7C）。

图7 分子量＜3 kDa的组分、Rg1以及＜3 kDa组分＋Rg1对小鼠海马胆碱能功能和BDNF信号通路的影响

＜3 kDa和Rg1治疗后调节BDNF/TrKB/CREB通路的潜在机制

用4 mg/mL东莨菪碱处理PC12细胞4 h后，细胞出现凋亡迹象（图8A），细胞存活率降至（50.14±0.74）%。因此，用4 mg/mL东莨菪碱处理4 h是在PC12细胞中人工制造损伤条件的最佳方案。通过MTT法测定Rg1组、＜3 kDa组和＜3 kDa＋Rg1组中PC12细胞的毒性和存活率，浓度范围为25～800 µg/mL（图8B）。400 µg/mL的剂量对PC12细胞无毒性作用，因此选择400 µg/mL作为后续实验的浓度。Rg1、＜3 kDa和＜3 kDa＋Rg1处理均能保护PC12细胞免受东莨菪碱诱导的损伤，其中＜3 kDa＋Rg1的保护作用最强（图8C）。给予1～100 µmol/L的7,8-DHF既不促进细胞增殖也不促进细胞凋亡（图8D）。与4 mg/mL东莨菪碱共孵育4 h后，25 µmol/L的7,8-DHF表现出最强的保护作用（图8E）。因此，7,8-DHF的最佳浓度为25 µmol/L。据此，在给予4 mg/mL东莨菪碱诱导细胞损伤4 h后，分析了400 µg/mL＜3 kDa核桃肽、Rg1、＜3 kDa核桃肽＋Rg1以及25 µmol/L 7,8-DHF对神经元细胞的治疗效果。为进一步评估＜3 kDa核桃肽、Rg1以及＜3 kDa核桃肽＋Rg1调节神经递质含量和胆碱能功能的机制，使用TrKB拮抗剂ANA-12和激动剂7,8-DHF对PC12细胞进行了处理（图8F）。结果显示＜3 kDa、Rg1、以及＜3 kDa＋Rg1处理通过促进 BDNF/TrKB/CREB 信号通路和提高Trx-1蛋白水平，增强了神经递质和胆碱能功能。

图8 ＜3 kDa的组分、Rg1、以及＜3 kDa＋Rg1共同增强了神经递质和BDNF信号通路的调控机制

Conclusion

综上所述，＜3 kDa＋Rg1联合治疗对东莨菪碱所致认知障碍小鼠具有缓解作用。与单独使用＜3 kDa或Rg1相比，＜3 kDa＋Rg1联合治疗通过调节神经递质含量和恢复海马体DG区的神经元，显著改善了小鼠的记忆力。此外，＜3 kDa＋Rg1能够过表达Trx-1，并激活BDNF/TrKB/CREB信号通路，从而增强胆碱能功能并提高记忆能力。研究结果表明，源自核桃和人参的天然产物（核桃中的＜3 kDa肽和人参水煎剂中的Rg1）或可作为功能性食品补充剂，用于缓解认知障碍和增强记忆能力。

Walnut peptide and ginseng Rg1 co-treatment prevents the loss of neurons and cognitive decline in mouse model with memory impairment

Junxi Fua, Kuzdeuova Damiraa, Wentian Songa, Weijia Lia, Li Fanga, Yue Lenga, Chunlei Liua, Dan Wua,*, Weihong Minb,c,*

a College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China

b College of Food and Health, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, China

c The State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, China

*Corresponding author.

Abstract

In study, we investigated the effect of treatment with combination of walnut peptides with molecular weight < 3 kDa and ginsenoside Rg1 (< 3 kDa + Rg1) on scopolamine-induced cognitive impairment in mice and the mechanism of brain-derived neurotrophic factor (BDNF)/tyrosine kinase B (TrKB)/cAMP response element-binding protein (CREB) signaling pathway in PC12 cells. In behavioral experiments, < 3 kDa + Rg1 treatment improved the memorizing ability of mice. Treatment with < 3 kDa + Rg1 significantly regulated the function of neurotransmitters and effectively improved the morphology of the neurons determined by hematoxylin and eosin (H&E), Nissl, and Golgi staining. Additionally, immunohistochemistry showed that the < 3 kDa + Rg1 treatment significantly decreased acetylcholinesterase (AChE) activity and increased choline acetyl transferase (ChAT) content in the hippocampus. The treatment upregulated vesicular acetylcholine transporter (VAChT), activated the BDNF/TrKB/CREB signaling pathway, improved the remodeling of dendritic spines, and enhanced cholinergic functions. In the scopolamine-induced PC12 cells, combination treatment increased thioredoxin-1 (Trx-1) expression after administering TrKB and activated signaling pathway. The results showed combination of < 3 kDa + Rg1 activated the BDNF/TrKB/CREB signaling pathway by regulating function of neurotransmitters and enhanced cholinergic function to decrease cognitive impairment.

Reference:

FU J X, DAMIRA K, SONG W T, et al. Walnut peptide and ginseng Rg1 co-treatment prevents the loss of neurons and cognitive decline in mouse model with memory impairment[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(7): 9250156. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250156.

翻译： 管勤昊（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：摄图网

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