T细胞衔接器的设计：活性与安全性的平衡策略

引言

T细胞是抗肿瘤免疫的核心效应细胞，可通过识别主要组织相容性复合体（MHC）分子呈递的抗原肽直接清除肿瘤细胞。然而，能够介导有效肿瘤杀伤的肿瘤特异性T细胞库通常受限，而肿瘤微环境（TME）中的大多数T细胞是肿瘤非依赖性的旁观者T细胞。因此，将旁观者T细胞重定向至肿瘤细胞的策略已成为基于T细胞的免疫治疗的重要方向。

TCEs是同时结合T细胞和肿瘤细胞的双特异性抗体，其中大多数靶向CD3，以招募广泛的T细胞，以抗原非依赖的方式介导肿瘤细胞杀伤。临床实践中，TCEs在血液系统恶性肿瘤中已展现出显著疗效，特别是针对CD19、CD20和BCMA等B细胞抗原的相关疾病。此外，通过靶向DLL3和gp100等靶点，TCEs在特定实体瘤中也显示出令人鼓舞的活性。迄今为止，已有12种TCEs获得批准，包括2017年撤回、2025年重新获批的卡妥索单抗，另有5种TCEs已进入III期临床评估。

一、TCEs实现T细胞活化的控制因素

类似于单克隆抗体，TCEs通常通过静脉或皮下途径给药。尽管全身给药能够有效靶向血液系统恶性肿瘤中的抗原，但实体瘤固有的物理屏障显著限制了药物的渗透和瘤内分布。因此，TCEs在实体瘤中的治疗疗效从根本上由其在肿瘤部位的暴露特征决定，包括药物的定位和持续存在。与此同时，正常组织中的非肿瘤暴露仍然是毒性的关键驱动因素。

抗CD3亲和力

T细胞受体（TCR）-CD3八聚体复合物由异二聚体TCR（α/β或γ/δ）和六个CD3链（ε/γ、ε/δ、ζ/ζ）组成。功能上，TCR识别肽-MHC复合物并通过CD3转导信号，触发T细胞活化。CD3，尤其是CD3ε，已成为TCE设计的首要靶点，因为它既能放大活化信号，又能防止过度活化。有效的CD3磷酸化对于TCE介导的T细胞活化至关重要，并且该过程高度依赖于TCE对CD3的亲和力。然而，优化CD3亲和力面临着关键难题：过高的亲和力可能触发非靶依赖的T细胞活化，增加全身性细胞因子释放并加速T细胞耗竭，而亲和力不足可能无法在免疫抑制的TME中诱导强效的T细胞活化。找到恰当的平衡对于最大化肿瘤杀伤同时最小化细胞因子介导的毒性至关重要。

对于某些高亲和力抗CD3 TCEs，即使在低剂量下T细胞活化和细胞因子释放也可能发生。虽然降低CD3亲和力是通过减轻细胞因子释放来拓宽治疗窗的直接方法，但许多临床使用的TCEs以中等亲和力和单价方式结合CD3。由于完全T细胞活化通常需要靶点介导的交联，简单的亲和力降低可能损害肿瘤杀伤。这里提出一种更精细的策略，称为“动力学调节”，即通过增加koff同时相应增加kon来维持平衡亲和力Kd。这种方法可能减少外周CD3占用的持续时间，从而最小化非靶向启动和T细胞的不期望迁移行为，同时维持足够进行细胞毒性的瞬时相互作用。因此，亲和力优化不仅应考虑T细胞活化，还应考虑结合动力学如何调节体内药理学，整合药效学和药代动力学考量以实现更安全、更有效的TCE设计。

整合额外活化信号

T细胞活化遵循经典的三信号模型，包括TCR-pMHC结合（信号1）、共刺激（信号2）和细胞因子信号（信号3）。TCE结合CD3传递信号1，这是完全活化的必要但不充分条件。由共刺激受体介导并由免疫检查点调节的信号2同样至关重要。由于TCE诱导的T细胞扩增需要超越CD3连接本身的输入，将信号2整合到TCE设计中已成为增强T细胞效应功能和整体治疗活性的关键策略。

共刺激受体，包括CD28、4-1BB（CD137）、CD2和ICOS（CD278），在增强T细胞活化中发挥关键作用。其中，CD28通过与抗原呈递细胞（APCs）上的CD80或CD86结合来提供信号2。尽管CD28可作为CD3的替代活化模块，但其在静息和活化T细胞上均有表达，这意味着仅结合CD28的TCEs可能面临加速T细胞耗竭和过度炎症性细胞因子释放的风险。相比之下，4-1BB通常被认为是一种更安全的共刺激靶点，因为其表达是可诱导的，且主要限于活化T细胞，其信号传导依赖于持续的抗原驱动刺激。此外，4-1BB信号促进记忆T细胞亚群的扩增，这一特点可用于4-1BB靶向的TCEs以扩大抗肿瘤免疫。

在实体瘤中，免疫检查点分子，特别是程序性细胞死亡蛋白1及其配体PD-L1，通常通过抑制CD8⁺ T细胞的细胞毒性来介导免疫逃逸。抗体介导的阻断可以部分逆转T细胞耗竭并恢复CD8⁺ T细胞功能。将检查点抑制整合到TCEs中可能进一步增强这些效应并对抗免疫抑制。

TCE传递的信号1与天然TCR产生的信号有着根本区别，TCE介导的单独信号1通常不足以维持强效的T细胞活化的。为解决此限制，可将细胞因子纳入TCE设计以提供信号3，从而支持T细胞增殖、分化和存活以延长持续存在。例如，白细胞介素-2直接结合T细胞上的IL-2受体以增强这些功能。

受体介导的T细胞亚群招募

传统的CD3靶向TCEs最初是为招募细胞毒性T淋巴细胞进行肿瘤清除而开发的。由于CD3在所有T细胞谱系中表达，这些TCEs不加区分地活化的CD8⁺和CD4⁺ T细胞。这种非选择性活化的可能导致免疫抑制性调节性T细胞的招募，以及CD4⁺ T细胞的活化，这是导致细胞因子释放综合征的主要因素。因此，对选择性靶向特定T细胞亚群可以改善活性和安全性。

二、工程化TCE的设计考虑

肿瘤抗原选择

目前，大多数TCEs靶向肿瘤相关抗原，这些抗原在恶性肿瘤中过表达，但在正常成人组织中通常保留可检测的表达。尽管肿瘤特异性抗原在理论上更具优势，但TAAs由于具有更广泛的充分表征靶点库，仍然是临床开发的主要支柱。这一策略在血液系统恶性肿瘤中特别成功。所有已获批或正在临床开发的TCEs中，约26%靶向三种TAAs——CD19、CD20和BCMA，凸显了它们近乎理想的靶点地位。CD20在B细胞和非霍奇金淋巴瘤中高表达，但在造血干细胞和浆细胞中不表达。同样，CD19在B细胞谱系中广泛表达，而BCMA特异于浆细胞，在HSCs或大多数非造血组织中不表达。关键在于，B细胞的再生能力进一步降低毒性风险。

实体瘤中的靶点选择更具挑战性，候选抗原常常在重要正常组织中共同表达，且免疫抑制性TME进一步要求强效的TCE活性。迄今为止，仅有两种TCEs获得FDA批准，包括tarlatamab用于小细胞肺癌和tebentafusp用于葡萄膜黑色素瘤。DLL3是Notch通路中的抑制性配体，在SCLC和其他神经内分泌肿瘤中高表达，在大多数正常组织中表达极少。尽管在某些脑区可检测到，但OTOT毒性因TCEs穿越血脑屏障的能力有限而得到缓解。同样，gp100是一种谱系限制性抗原，主要在黑色素细胞和黑色素瘤中表达，具有高组织特异性和有利的安全性特征。

总之，抗原选择需要多因素的平衡。特异性本身是不够的；肿瘤细胞表面的抗原密度也是TCE活性的关键决定因素，控制着免疫突触形成的概率、重定向T细胞的活化的阈值和整体抗肿瘤细胞毒性。因此，在某些情况下，高表达的TAAs可能优于低密度的TSAs。最佳抗原选择需要在肿瘤特异性与抗原丰度以及有效T细胞结合所需活性之间取得平衡。此外，理想的肿瘤抗原通常与恶性表型存在功能联系，从而降低通过抗原突变或丢失实现免疫逃逸的风险。

通过价态和亲和力调节优化

调节分子格式，特别是价态，为增强肿瘤细胞上的功能性亲和力提供了主要途径。例如，mosunetuzumab是一种异源二聚体1+1 IgG格式TCE，于2022年获批用于NHL和MM。相比之下，glofitamab于2023年获批用于DLBCL，采用异源二聚体“2+1”格式，具有两个CD20结合臂和一个CD3结合臂。这种双价肿瘤结合增加了在肿瘤细胞上的功能性亲和力，从而增强了T细胞重定向和细胞毒性。临床前研究报告称，glofitamab的体外细胞毒性比传统IgG形式增强了约40倍。这种高亲和力设计还有助于在低抗原密度条件下维持活性。临床上，glofitamab联合标准化疗在3期STARGLO试验中实现了25.5个月的中位总生存期。增加价态的类似策略包括基于IgM的TCEs。天然IgM抗体通过五聚体或六聚体组装（10或12个结合位点）实现高功能性亲和力，尽管单个位点亲和力相对较低。Imvotamab是一种工程化IgM格式TCE，包含十个高亲和力抗CD20臂和一个通过J链融合的单抗CD3臂。它目前正在I-II期试验中进行评估。

相比之下，亲和力调节提供了一种增强肿瘤选择性的替代方法。例如，一种含有两个低亲和力抗HER2 Fab臂的抗HER2×CD3 TCE，使其能够优先靶向高HER2表达的肿瘤细胞，同时避免正常组织低水平表达。更广泛地说，调节亲和力和价态可以利用抗原密度阈值来改善选择性。靶向同一TAA内的不同表位可能进一步细化这种效果。

具有AND/OR门控的双TAA靶向TCE设计

当单个TAA无法提供足够的结合亲和力或肿瘤选择性时，双重靶向策略提供了有效的替代方案。这类TCEs根据药理学意图分为两类：OR门控和AND门控设计。OR逻辑TCEs配置为使任一抗原的结合足以触发生产性T细胞活化的。因此，每个肿瘤结合臂必须保留足够的固有亲和力和功能活性。在这种情况下，OR设计有助于减轻抗原异质性并减少由抗原阴性克隆生长引起的复发。例如，已开发了一种靶向CD19×CD22×CD3的三特异性TCEs，以减少与抗原丢失相关的免疫逃逸。

相比之下，AND逻辑TCEs被设计为优先在共表达两种靶抗原的细胞上活化的T细胞。这通常通过使用较低亲和力的单个结合子来实现，使得在双阳性情境中通过协同亲和力实现有效积累和突触形成。AND逻辑设计非常适合实体瘤，因为候选抗原通常与正常组织共享，且精确区分至关重要。这里，降低的单价亲和力最小化了与单阳性正常细胞的生产性结合，而双抗原共表达驱动了亲和力依赖的滞留和强效的T细胞重定向。例如，靶向EGFR×EpCAM×CD3的三特异性TCEs在体外对双阳性肿瘤细胞的细胞毒性比单阳性细胞高约100倍。AND逻辑TCEs也可能在血液系统恶性肿瘤中具有潜力。ISB 2001在临床前研究中显示出比单靶向TCEs（如teclistamab）更优的骨髓瘤细胞杀伤，目前正在复发/难治性MM的I期试验中进行评估。通过同时靶向同一肿瘤抗原上的多个表位——一种特殊形式的AND逻辑TCE——可以进一步增强肿瘤选择性。例如，BR115同时结合HER2 ECD2和HER2 ECD4以及CD3，已进入I期临床评估。

总体而言，OR和AND逻辑不仅在亲和力调节上不同，在其潜在机制上也不同。OR门控主要解决抗原异质性，这在靶抗原分布在部分重叠的肿瘤细胞群体中时尤为相关。相比之下，AND门控强制双抗原重合以改善选择性，并可以纳入不对称亲和力调节以最小化单抗原的主导结合。因此，多特异性TCEs作为OR或AND逻辑装置的功能行为由靶点选择、亲和力调节和分子形式的综合效应决定。

TME内TCE的条件活性化

为设计在TME中选择性活化的TCEs，可以利用肿瘤相关蛋白酶、升高的细胞外ATP和酸性pH等特征来区分恶性与正常组织。其中，蛋白酶触发的活化的已成为突出策略。例如，一种Probody EGFR×CD3 TCE包含一个肽“掩蔽物”，可阻断抗原结合区域，并被肿瘤相关蛋白酶选择性地切割以恢复靶点结合。临床前研究中，该设计在体外对EGFR阳性肿瘤细胞实现了超过15,000倍的选择性，相对于未掩蔽的对照品，并在结肠癌异种移植模型中诱导了剂量依赖性肿瘤消退。在非人灵长类动物中，安全性也显著改善，其MTD比未掩蔽的对照品高出约60倍。类似地，一种Probody HER2×CD3 TCE在肿瘤中表现出蛋白酶依赖性活性，同时在正常组织中保持无活性，在NHPs中的MTD比未掩蔽版本高出约400倍。总体而言，Probody技术旨在通过最大化瘤内活性同时最小化OTOT毒性来拓宽治疗窗，目前正在实体瘤和特定淋巴瘤中进行临床评估。

除蛋白酶外，TME相关的代谢线索提供了条件活化的的替代触发因素。正常组织与TME之间细胞外ATP水平的差异已被利用来设计条件活性生物制剂，包括改善抗CD137抗体安全性的策略。同时，肿瘤细胞中持续的有氧糖酵解驱动乳酸积累和TME酸化，为pH依赖性活化的方法提供了基础。总体而言，TME响应性活化的策略有望扩大可靶向的肿瘤抗原范围，特别是在实体瘤中。

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三、超越分子设计的TCE活性-安全性平衡决定因素

给药方案和给药途径

给药频率和给药途径是临床疗效的关键决定因素。blinatumomab、tebentafusp和mosunetuzumab等CD3结合双特异性抗体的临床经验验证了逐步递增给药的实用性。通过从低剂量开始，逐步递增至目标剂量水平，该策略有助于更安全的免疫结合并减轻CRS。皮下给药提供了一种补充方法来进一步优化治疗指数。通过降低峰血浆浓度，SC给药途径可以减轻毒性而不影响总体药物暴露，同时提升患者便利性。在食蟹猴中的临床前研究支持这一特征：虽然DuoBody CD3×CD20 TCE通过静脉和SC两种途径显示出的相当疗效，但SC途径产生了显著更低的峰抗体浓度和相应的更低血浆细胞因子水平。然而，SC途径促进淋巴吸收并增加与APCs的相互作用，可能提高抗药物抗体形成的风险。因此，虽然SC途径具有减少细胞因子释放的益处，但其诱导免疫原性的潜力需要仔细考虑。

半衰期优化的药代动力学效应

TCEs的半衰期是其药代动力学特征的主要决定因素。例如，含Fc的形式利用Fcγ受体介导的再循环来延长全身循环时间。为确保安全性，这些Fc结构域通常经过工程化沉默突变以消除效应功能，包括抗体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞吞噬作用，从而防止非特异性免疫活化的。或者，与人血清白蛋白结合提供了一种延长半衰期的可行策略，而不损害对肿瘤抗原的特异性结合。然而，半衰期延长从时空角度引入了关键权衡。虽然延长的全身暴露是可取的，但伴随的分子大小增加可能阻碍组织穿透并限制在实体瘤核心内的药物积累。因此，优化半衰期需要在全身可用性和瘤内分布之间仔细平衡。

此外，半衰期还通过靶点介导的药物处置受到靶点生物学和结合亲和力的约束。在正常组织中丰富表达的抗原可以作为“抗原池”，通过非肿瘤结合加速清除。例如，靶向EGFR的TCEs因EGFR在正常组织中广泛表达而常常表现出缩短的半衰期。高结合亲和力可能进一步加剧这种内化和降解。为减轻此类非特异性清除，可以采用亲和力调节或加入掩蔽肽等策略以最小化非预期相互作用。

递送方式和联合疗法

创新的递送方法，包括溶瘤病毒和CAR-T细胞，实现了局部TCE产生，从而增加瘤内暴露和抗肿瘤活性。OVs提供了双重作用机制：它们诱导局部炎症以招募T细胞到肿瘤，并充当TCE生产的原位工厂。这种局部表达增强了瘤内药物浓度，同时减少了全身暴露，从而扩大了治疗窗。虽然病毒复制可以通过旁观者效应增强抗原异质性细胞的杀伤，但OVs的复制能力和免疫原性必须仔细平衡以维持安全性。

类似地，CAR-T细胞可以被工程化为“活载体”，以肿瘤依赖的方式递送TCEs。在抗原识别后，这些细胞可以被编程为分泌TCEs，从而介导双重作用机制：CAR-T细胞的直接肿瘤细胞溶解和分泌的TCEs对内源性T细胞的招募。当前的努力聚焦于精细调节TCE分泌的幅度、时间和定位，以减轻CRS和过度免疫活化的。尽管载体介导的TCE递送策略前景广阔，但其临床转化取决于克服与载体安全性、递送效率和在TME中性能相关的挑战。

参考文献：

Designing T-cell Engagers: Trade-offs Between Activity and Safety. Protein Cell. 2026 Jun 4:pwag038.