Targetome I 雷公藤红素“精准制动” CTSS，驱动 iNKT1 保护性极化，强力缓解胆汁淤积肝损伤 (王欣之/柳军/邢孟韬-中国药科大学)

胆汁淤积性肝损伤是一类由胆汁形成、分泌或排泄受阻引发的肝脏疾病，可伴随胆汁酸蓄积、肝脏炎症、肝细胞损伤，并进一步进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。当前临床治疗手段仍较有限，尽管熊去氧胆酸是常用一线药物，但仍有相当比例患者应答不佳。因此，寻找新的治疗靶点和干预策略，是胆汁淤积相关肝病研究中的重要方向。

近日，中国药科大学王欣之、柳军、邢孟韬团队在Targetome在线发表题为 “Celastrol ameliorates cholestatic liver injury by promoting a protective iNKT1 polarization via CTSS inhibition and autophagy restoration” 的研究论文。

该研究聚焦：胆汁淤积性肝损伤中 iNKT 细胞亚群失衡及其免疫调控机制，围绕天然产物雷公藤红素如何通过靶向组织蛋白酶 S（CTSS）调节自噬/线粒体自噬、促进保护性 iNKT1 极化并缓解肝损伤和纤维化展开系统研究。

iNKT 细胞是连接先天免疫与适应性免疫的重要免疫细胞群，能够快速产生 IFN-γ、IL-4、IL-17 等效应细胞因子，并在肝脏炎症和免疫稳态中发挥关键作用。既往研究表明，致病性 iNKT17 细胞可参与胆汁淤积性肝损伤进展，而如何药理性调控 iNKT 细胞亚群、将其从促炎损伤状态转向保护状态，仍缺乏明确机制和有效策略。

本研究发现，雷公藤红素可显著减轻 EE 和 ANIT 诱导的胆汁淤积性肝损伤，降低血清 AST、ALT、ALP 等肝损伤指标，改善肝组织坏死、炎症浸润和假胆管样增生，并恢复 FXR 及胆汁酸转运、合成和代谢相关分子的表达，提示其具有改善胆汁酸稳态和缓解肝损伤的双重作用。

进一步研究显示，雷公藤红素不仅作用于胆汁酸代谢通路，还显著重塑肝脏免疫微环境。其可促进 iNKT 细胞由致病性 iNKT17 偏向转变为保护性 iNKT1 偏向，表现为 IFN-γ^+ iNKT1 细胞比例升高、IL-17^+ iNKT17 细胞比例下降。体外 iNKT-肝细胞共培养实验进一步证明，雷公藤红素通过调节肝细胞与 iNKT 细胞之间的相互作用，降低肝细胞 Cd1d 和 Il12 表达，从而影响 CD1d 介导和 IL-12 介导的 iNKT 细胞激活过程。

在机制层面，研究团队通过分选肝脏 iNKT 细胞并进行转录组分析，发现雷公藤红素显著影响吞噬体、溶酶体以及抗原加工与呈递通路，其中 CTSS 被鉴定为关键枢纽靶点。胆汁淤积状态下，CTSS 在 iNKT 细胞中显著升高；而雷公藤红素可下调 CTSS 表达，并通过直接结合 CTSS 抑制其功能。SPR 和分子对接实验进一步支持雷公藤红素与 CTSS 之间存在直接相互作用。

值得注意的是，CTSS 并非仅是一个伴随变化的分子标志物，而是雷公藤红素发挥作用的关键节点。CTSS 抑制剂 Z-FL-COCHO 可模拟雷公藤红素的保护效应，减轻胆汁淤积性肝损伤、恢复胆汁酸稳态并促进自噬/线粒体自噬；而 CTSS 过表达则会削弱雷公藤红素的保护作用。更关键的是，在 CTSS 敲除小鼠中，雷公藤红素诱导 iNKT1 极化和肝保护的作用被消除，证明 CTSS 是雷公藤红素发挥免疫调节和肝保护作用不可或缺的靶点。

该研究还揭示了 CTSS—自噬/线粒体自噬—iNKT1 极化 这一关键轴线。胆汁淤积状态下，iNKT 细胞自噬和线粒体自噬受损；雷公藤红素通过抑制 CTSS 恢复自噬流，降低 p62、提高 LC3II/I、Parkin 和 PINK1 等自噬/线粒体自噬标志物水平。使用氯喹阻断溶酶体降解后，雷公藤红素诱导的自噬恢复、iNKT1 极化和肝保护作用均被削弱，说明自噬恢复是其免疫重塑作用的必要环节。

此外，研究还将这一机制拓展至 CCl4 诱导的肝纤维化和急性肝损伤模型。结果显示，雷公藤红素同样能够抑制 CTSS、恢复自噬、促进 iNKT1 偏向，并减轻胶原沉积、降低纤维化标志物和改善肝损伤。该发现提示 CTSS-自噬-iNKT1 轴不仅参与胆汁淤积性肝损伤，也可能是肝纤维化及其他炎症性肝病中的共性免疫调控机制。

临床相关性方面，研究发现 ICP 患者 PBMC 中 CTSS mRNA 水平显著升高，并结合公开单细胞测序数据发现，在胆汁淤积及肝纤维化相关模型中，NKT 细胞发生显著改变且 CTSS 表达升高。这些结果增强了 CTSS 作为潜在临床治疗靶点的转化价值。

总体而言，该研究提出了雷公藤红素治疗胆汁淤积性肝损伤的新机制：雷公藤红素通过靶向抑制 CTSS，恢复 iNKT 细胞自噬/线粒体自噬，促进保护性 iNKT1 极化，同时改善肝细胞胆汁酸稳态和抗原呈递功能，最终减轻胆汁淤积性肝损伤及纤维化进展。该工作不仅拓展了对胆汁淤积免疫病理机制的认识，也为以 CTSS 和 iNKT 细胞极化为核心的免疫干预策略提供了新的理论依据和潜在药物开发方向。

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【摘要】

胆汁淤积性肝损伤涉及致病性恒定自然杀伤 T17（iNKT17）细胞扩增，目前治疗手段有限。雷公藤红素虽显示出保肝潜力，但其在胆汁淤积和纤维化过程中调控 iNKT 细胞驱动病理变化的机制仍不清楚。本研究旨在阐明雷公藤红素如何调控 iNKT 细胞极化，从而改善胆汁淤积性肝损伤及纤维化进展。

雷公藤红素可减轻胆汁淤积性肝损伤和纤维化，并恢复胆汁酸稳态。它将肝脏 iNKT 细胞平衡从致病性 iNKT17 细胞转向保护性 iNKT1 细胞。对分选的肝脏 iNKT 细胞进行转录组分析发现，组织蛋白酶 S（CTSS）是关键枢纽基因，将雷公藤红素的作用与吞噬体/溶酶体通路联系起来。雷公藤红素可结合并抑制 CTSS，进而增强 iNKT 细胞中的自噬和线粒体自噬。

机制上，氯喹介导的溶酶体阻断削弱了雷公藤红素诱导的 p62 降解、自噬流、iNKT1 极化和肝保护作用。CTSS 抑制可模拟雷公藤红素的获益作用，而 CTSS 过表达则消除了这些作用。更关键的是，在 CTSS 敲除小鼠中，雷公藤红素的肝保护作用和诱导 iNKT1 极化的作用均被消除，证实 CTSS 对雷公藤红素发挥作用至关重要。

临床相关性方面，妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）患者外周血单个核细胞（PBMC）中 CTSS mRNA 水平显著升高。此外，利用 CD1d 缺陷小鼠，研究确定 iNKT 细胞是胆汁淤积中 CTSS 致病性上调的主要细胞来源。本研究揭示 CTSS 是胆汁淤积及其纤维化进展中的关键分子检查点，其通过调控自噬/线粒体自噬来控制 iNKT 细胞极化，因此为胆汁淤积性肝损伤提供了新的治疗靶点。

01

研究背景及科学问题

胆汁淤积性肝损伤是一类常见肝脏病变，其特征是胆汁形成、分泌和流动受损，并伴随毒性胆汁酸蓄积、炎症和肝脏损伤。若不能得到有效干预，可进展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌。然而，胆汁淤积性肝损伤目前可用的治疗选择有限。熊去氧胆酸（UDCA）是推荐的一线药物，可促进胆汁酸排泄，但多达 40% 的患者对其无应答。因此，迫切需要开发针对胆汁淤积性肝损伤的新治疗靶点和药物。

雷公藤红素被《Cell》评为最具前景的天然产物之一，因其在多种适应证中具有广泛药理应用而受到高度关注。它具有强效的抗癌、抗炎、抗肥胖和保肝作用。在妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）大鼠中，雷公藤红素可通过降低血清基质金属蛋白酶 MMP-2 和 MMP-9 水平来缓解胆汁淤积。它还可通过激活沉默信息调节因子 1（SIRT1）和法尼醇 X 受体（FXR），并抑制核因子 κB（NF-κB）和 P53 信号通路，减轻 α-萘异硫氰酸酯（ANIT）和硫代乙酰胺（TAA）诱导的胆汁淤积性肝损伤。KEGG 通路分析进一步提示，雷公藤红素可调节炎症和胆汁酸稳态。

肝脏非实质细胞被发现可在胆汁淤积性肝损伤中发挥驱动和促进作用。单细胞测序和空间转录组分析显示，胆道闭锁患者肝脏中非实质细胞富集，包括巨噬细胞、自然杀伤 T（NKT）细胞、B 细胞和细胞毒性 T 细胞。耗竭 B 细胞或阻断抗原呈递可减轻肝损伤，提示靶向肝脏非实质细胞对胆汁淤积性肝病具有良好的治疗潜力。

恒定 NKT（iNKT）细胞是一类特殊的先天免疫细胞亚群，兼具 T 细胞和自然杀伤（NK）细胞特征。它们可在抗原刺激激活后通过 T 细胞受体（TCR）依赖机制迅速产生效应分子，也可在细胞因子刺激下通过 TCR 非依赖机制发挥作用。类似于传统 T 细胞，iNKT 细胞可根据其表达的效应分子分为不同功能亚群：分泌 IFN-γ 的 iNKT1、分泌 IL-4 的 iNKT2，以及分泌 IL-17 的 iNKT17。肝脏 iNKT 细胞，尤其是 iNKT17 细胞，会增加并参与胆汁淤积性肝病进展。

溶酶体蛋白酶组织蛋白酶在肝病的发生、发展和进展中具有重要作用。它们参与多种生物过程，如凋亡、自噬、肝星状细胞（HSC）活化和炎症。慢性肝病患者血浆中组织蛋白酶 B（CTSB）、L 和 D 水平与肝纤维化/肝硬化的发展呈正相关。组织蛋白酶参与复杂的信号级联和网络，如 B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、NF-κB 和 NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3（NLRP3）信号通路。CTSS 主要表达于免疫细胞中，其表达可被炎症刺激诱导，并参与抗原呈递和细胞内蛋白降解。CTSS 参与 iNKT 细胞的直接激活（CD1d 介导）和间接激活（IL-12 介导），也参与其效应功能，如 IFN-γ 分泌。然而，CTSS 如何通过调控 iNKT 细胞活性参与胆汁淤积仍不清楚。

雌激素是诱发胆汁淤积性肝损伤的重要危险因素，相关情况包括 ICP、口服避孕药使用或绝经后激素治疗。我们此前研究表明，iNKT17 细胞通过招募中性粒细胞和单核细胞放大肝脏炎症，在炔雌醇（EE）诱导的胆汁淤积性肝损伤中发挥关键作用。此外，iNKT 细胞缺陷可缓解 ANIT 诱导的胆汁淤积性肝损伤。尽管已有这些发现，但胆汁淤积中调控 iNKT 细胞亚群的治疗靶点和药理策略仍缺乏深入认识，需要进一步探索。

本研究发现，雷公藤红素通过抑制 CTSS 并增强 iNKT 细胞后续的自噬/线粒体自噬，在肝脏微环境中诱导保护性 iNKT1 偏向，从而减轻胆汁淤积性肝损伤和纤维化进展。iNKT 细胞是哺乳动物中进化上最保守的非常规 T 细胞亚群之一，提示其具有很大的临床转化潜力。本研究揭示了雷公藤红素治疗胆汁淤积的新药理机制和治疗靶点，为未来药物开发提供了方向，并有助于合理设计胆汁淤积性肝损伤的预防和治疗策略。

02

重要发现及亮点

雷公藤红素减轻 EE 和 ANIT 诱导的胆汁淤积

我们采用已建立的 EE 和 ANIT 诱导胆汁淤积模型，评估雷公藤红素的保护作用（图 1a 和 f）。雷公藤红素显著改善胆汁淤积表型，降低肝脏/体重比以及血清 AST、ALT 和 ALP 水平（图 1b 和 g）。组织病理学检查进一步证实，雷公藤红素可减轻坏死（黑色箭头）、炎症细胞浸润（红色箭头）和假胆管样增生（黄色箭头）（图 1c 和 h）。

机制上，雷公藤红素在转录和蛋白水平上均恢复了核受体 FXR 受抑制的表达（图 1d、e、i 和 j）。它还纠正了胆汁酸稳态紊乱，逆转了胆汁酸合成相关基因（Cyp7a1、Cyp27a1）、代谢相关基因（Cyp2b10）、摄取转运体（有机阴离子转运多肽 Oatp 和牛磺胆酸钠共转运多肽 Ntcp）以及替代外排转运体（多药耐药相关蛋白 3，Mrp3）表达下降的情况，同时调节了经典外排泵胆盐输出泵（Bsep）表达升高（图 1d 和 i）。雷公藤红素还恢复了 CYP2B10 的蛋白水平（图 1e 和 j）。

这些数据表明，雷公藤红素可保护机体免受 EE 和 ANIT 诱导的胆汁淤积损伤。

图 1｜雷公藤红素保护机体免受 EE 和 ANIT 诱导的胆汁淤积。
（a）雷公藤红素和 EE 的给药方式。（b）、（g）肝脏/体重比，以及血清 AST、ALT 和 ALP 水平。（c）、（h）肝脏 H&E 染色（200×，比例尺 = 50 μm；黑色箭头：坏死；红色箭头：炎症浸润；黄色箭头：假胆管样增生；蓝色箭头：肝窦充血）。（d）、（i）胆汁酸稳态关键相关基因的 mRNA 表达。（e）、（j）FXR 和 CYP2B10 的蛋白水平。（f）雷公藤红素和 ANIT 的给药方式。数据以均值 ± SEM 表示，n = 5–6；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与对照组相比； < 0.05，# < 0.01，## < 0.001，与 EE 或 ANIT 组相比。

雷公藤红素通过与肝细胞串扰促进保护性 iNKT1 极化

我们此前研究表明，iNKT17 细胞在 EE 诱导的胆汁淤积中发挥关键作用，而 iNKT 细胞缺陷可保护机体免受 ANIT 诱导的胆汁淤积损伤。因此，我们研究了雷公藤红素对 iNKT 细胞的影响。CD3e^int CD1d-PBS57 tetramer^+ 被用作识别 iNKT 细胞的特异性标志物（图 2a）。

与 EE 和 ANIT 诱导的胆汁淤积组相比，雷公藤红素促进了 iNKT 细胞活化（CD69^+ iNKT 细胞），增加了 iNKT1 细胞（IFN-γ^+ iNKT 细胞）比例，并降低了 iNKT17 细胞（IL-17^+ iNKT 细胞）比例，使 iNKT17 亚型偏向转变为 iNKT1 亚型偏向（图 2b–e）。不同于传统 Th1 和 Th2 细胞，iNKT1 细胞被认为具有保护作用，而 iNKT2 细胞可通过上调 FasL 和颗粒酶 B 表达诱导肝损伤。

体外实验中，雷公藤红素可在单独培养条件下激活 DN32.D3 细胞，但不诱导亚型偏向（补充图 S1a 和 S1b）。考虑到体内结果，我们采用两种共培养模型来研究肝脏微环境中与 iNKT 细胞相互作用的细胞（图 3b；补充图 S1c）。在不影响细胞增殖的浓度下（图 3a），iNKT-肝细胞共培养中，TCA 诱导的 AML12 细胞胆汁淤积性肝损伤在与 DN32.D3 细胞共培养后加重，而雷公藤红素在 AML12 单独培养和共培养系统中均减轻了肝毒性（图 3c）。在共培养系统中，雷公藤红素恢复了 TCA 处理导致下降的 CYP7A1、CYP8B1 和 FXR 蛋白水平（图 3d）。雷公藤红素还减轻了 EE 处理共培养系统中的肝损伤（图 3h）。

与单独 TCA 或 EE 处理相比，雷公藤红素增加了 DN32.D3 细胞 IFN-γ 分泌，并减少 IL-4 和 IL-17 分泌（图 3e 和 i），也提示 iNKT1 亚型偏向（图 3f 和 j）。在共培养系统中的 AML12 细胞中，雷公藤红素降低了 TCA 诱导的 Cd1d 和 Il12 mRNA 水平升高（图 3g），提示雷公藤红素通过肝细胞相互作用调节 iNKT 细胞的直接激活（CD1d 介导）和间接激活（IL-12 介导）。

尽管在不影响细胞增殖的浓度下，雷公藤红素也可在 DN32.D3 与 RAW264.7 细胞共培养时激活 DN32.D3 细胞（补充图 S1d），但与 LPS 组相比，它增加了 IL-4 和 IL-17 分泌，导致 iNKT17 偏向（补充图 S1e 和 S1f）。

因此，雷公藤红素优先通过与肝细胞相互作用诱导保护性 iNKT1 极化，从而发挥肝保护作用。

图 2｜雷公藤红素促进胆汁淤积肝脏中的 iNKT1 亚型偏向。
（a）iNKT 细胞（CD3e^int CD1d-PBS-57 tetramer^+）的门控策略。（b）、（d）CD69^+ iNKT 细胞、IFN-γ^+ iNKT1、IL-4^+ iNKT2 和 IL-17^+ iNKT17 细胞的比例及分析。（c）、（e）iNKT1/iNKT2 比值和 iNKT1/iNKT17 比值。数据以均值 ± SEM 表示，n = 4；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与对照组相比； < 0.05，# < 0.01，## < 0.001，与 EE 或 ANIT 组相比。

图 3｜雷公藤红素在 iNKT-肝细胞共培养中诱导 iNKT1 亚型偏向。
（a）AML12 细胞和 DN32.D3 细胞经雷公藤红素处理后的 IC50 值。（b）AML12 细胞与 DN32.D3 细胞体外共培养方式，以及 TCA 和雷公藤红素处理方式。在体外共培养系统中，（c）、（h）细胞上清液中的 AST 和 ALT 水平。（d）AML12 细胞中 CYP7A1、CYP8B1 和 FXR 的蛋白水平。（e）、（i）DN32.D3 细胞的活化情况（CD69）和细胞因子产生情况（IFN-γ、IL-4、IL-17）。（f）、（j）iNKT1/iNKT2 比值和 iNKT1/iNKT17 比值。（g）共培养系统中 AML12 细胞的 Cd1d 和 Il12 mRNA 水平。数据以均值 ± SEM 表示，n = 5；*P < 0.05，**P < 0.001，***P < 0.0001，与对照组相比； < 0.05，# < 0.001，## < 0.0001，与 TCA 或 EE 组相比；ΔP < 0.05，ΔΔΔP < 0.001，与 AML12 细胞相比。

雷公藤红素下调 CTSS 并促进 iNKT 细胞自噬/线粒体自噬

为鉴定雷公藤红素的潜在靶点，我们利用流式细胞术从 ANIT 组以及 ANIT 联合雷公藤红素组中分选肝脏 iNKT 细胞（纯度 > 99%）。转录组测序后，KEGG 分析显示，雷公藤红素显著影响吞噬体、抗原加工与呈递以及溶酶体通路（图 4a）。蛋白互作网络（PPI）分析表明，CTSS 是抗原加工与呈递中的中心靶点（图 4a）。

在体内和体外模型中，胆汁淤积均上调 CTSS 基因和蛋白水平，而雷公藤红素下调 CTSS 表达（图 4b 和 c）。更重要的是，ICP 患者 PBMC 中 CTSS mRNA 水平显著高于健康孕妇（图 4b）。吞噬体和溶酶体参与自噬过程。CTSS 对自噬相关降解和调控事件也至关重要，可维持细胞蛋白稳态和溶酶体功能。在胆汁淤积模型中，自噬标志物（p62 和 LC3II/I）以及线粒体自噬标志物（Parkin 和 PINK1）的表达均下降，而雷公藤红素恢复了其表达（图 4c）。

为表征雷公藤红素与 CTSS 的直接相互作用，研究使用重组 CTSS 蛋白进行了表面等离子体共振（SPR）实验。雷公藤红素与 CTSS 具有结合亲和力，平衡解离常数（KD）为 4.28 × 10^-5 mol·L^-1（图 4d）。此外，利用 AutoDock Vina 进行分子对接分析，以预测雷公藤红素与 CTSS 的潜在结合方式。预测结合能为 −9.2 kcal·mol^-1，并发现雷公藤红素与 CTSS 的 His164 之间存在氢键相互作用（图 4d），提示其具有稳定而特异的结合构象。

我们进一步分析了公开 10× Genomics 单细胞测序数据集（GSE166178），并通过 UMAP 可视化胆管结扎（BDL）小鼠和对照小鼠肝脏非实质细胞中的九种不同细胞类型。结果显示，BDL 小鼠与对照小鼠之间 NKT 细胞存在显著差异。KEGG 分析显示，NKT 细胞中的抗原加工与呈递通路以及 IL-17 信号通路显著上调（图 4e）。在 BDL 小鼠中，CTSS 表达在 NKT 细胞中升高，但在肝细胞、浆细胞样树突状细胞（pDC）、内皮细胞或 NK 细胞中并未升高（图 4e）。

此外，研究对胆汁淤积患者或小鼠肝脏与健康对照之间的差异表达基因（DEG）进行了 KEGG 富集分析。三个数据集的交集富集于八条通路，包括吞噬体通路（图 4f）。GSE79850 的火山图也显示，胆汁淤积患者肝脏中 CTSS 表达升高（图 4f）。上述结果提示，CTSS 是胆汁淤积性肝损伤的潜在病理靶点，也是雷公藤红素的潜在药理靶点。

图 4｜雷公藤红素下调 CTSS 并促进 iNKT 细胞中的自噬/线粒体自噬。
（a）流式分选肝脏 iNKT 细胞的结果、转录组测序差异表达基因（DEG）的 KEGG 富集通路分析，以及蛋白互作网络（PPI）分析。（b）体内、体外及患者样本中的 CTSS mRNA 水平。数据以均值 ± SEM 表示，n = 5–6；*P < 0.05，***P < 0.001，与对照组相比；# < 0.01，## < 0.001，与 EE、ANIT 或 TCA 组相比。（c）体内和体外 CTSS、p62、LC3I/II、Parkin 和 PINK1 的蛋白水平。（d）使用重组 CTSS 蛋白和雷公藤红素进行 SPR 实验获得的平衡解离常数（KD）。通过雷公藤红素与 CTSS 的分子对接预测结合区域和连接氨基酸（虚线表示 CTSS 与雷公藤红素之间的氢键作用，距离为 3.1 Å）。（e）单细胞测序数据集 GSE166178 中 BDL 和对照小鼠肝脏非实质细胞的 UMAP 可视化、NKT 细胞上调 DEG 的 KEGG 分析，以及 CTSS 的细胞类型特异性表达。（f）三个数据集（胆汁淤积患者或小鼠肝脏与健康对照）的共享 KEGG 通路韦恩图，以及 GSE79850 的火山图。

CTSS 抑制通过恢复自噬减轻胆汁淤积性损伤

为首先证实 iNKT 细胞在驱动 CTSS 表达中的核心作用，我们使用了缺乏 NKT 细胞的 CD1d 缺陷（CD1d KO）小鼠。重要的是，胆汁淤积诱导的肝脏 Ctss mRNA 上调在 CD1d KO 小鼠中明显消失（图 5a），有力证明 iNKT 细胞是胆汁淤积微环境中 CTSS 的主要细胞来源。与野生型小鼠相比，CD1d KO 小鼠表现出显著减轻的胆汁淤积性肝损伤，而雷公藤红素在 CD1d KO 小鼠中的肝保护作用被消除，说明 NKT 细胞对于雷公藤红素缓解胆汁淤积性肝毒性至关重要（图 5b 和 c）。

在共培养系统中，CTSS 抑制剂 Z-FL-COCHO 减轻了 TCA 诱导的肝毒性，抑制 CTSS 上调，并促进自噬/线粒体自噬（图 5d–g）。值得注意的是，DN32.D3 细胞中过表达 CTSS 消除了雷公藤红素的获益作用，包括降低 ALT/AST 释放和恢复自噬/线粒体自噬（图 5h–j）。通过 shRNA 敲低 DN32.D3 细胞中的 CTSS 表达也降低了细胞上清液中的 AST 和 ALT 水平，并抑制 DN32.D3 细胞中 p62 蛋白表达，说明遗传性抑制 CTSS 同样具有肝保护作用并可恢复自噬（图 5k–m）。此外，通过氯喹（CQ）阻断溶酶体降解后，雷公藤红素的肝保护作用被消除，表明自噬恢复对雷公藤红素的肝保护作用至关重要（图 5n 和 o）。

为进一步验证 CTSS 作为治疗靶点的作用，我们在胆汁淤积模型中给予 CTSS 抑制剂 Z-FL-COCHO（图 5p 和 u）。雷公藤红素和 Z-FL-COCHO 均可改善胆汁淤积表型，降低肝脏/体重比以及血清 AST、ALT 和 ALP 水平，并改善 EE 和 ANIT 诱导模型中的组织病理学改变（图 5q、r、v 和 x）。机制上，Z-FL-COCHO 处理恢复了 FXR 表达和胆汁酸调控因子（Cyp7a1、Mrp3、Bsep 和 CYP2B10），抑制 CTSS 上调，并增强自噬/线粒体自噬（p62 降低，LC3II/I 和 PINK1 增加）（图 5s、t 和 w）。更重要的是，CTSS 敲除后，雷公藤红素的肝保护作用被消除（图 5y）。这些结果证实，CTSS 是雷公藤红素作用机制的核心，且抑制 CTSS 足以减轻胆汁淤积并恢复自噬流。

图 5｜CTSS 抑制保护机体免受胆汁淤积性肝损伤。
（a）CD1d^-/- 小鼠中的 CTSS mRNA 表达，以及（b）血清 AST、ALT 和 ALP 水平。（c）、（r）和（x）肝脏 H&E 染色（黑色箭头：坏死；红色箭头：炎症浸润；蓝色箭头：肝窦充血）。（d）Z-FL-COCHO 处理 DN32.D3 和 AML12 细胞后的细胞活力。共培养系统中，（e）、（i）、（l）和（o）上清液 AST 和 ALT 水平。（f）DN32.D3 细胞中 Ctss 的 mRNA 表达。（g）DN32.D3 细胞中自噬/线粒体自噬标志物的蛋白水平。（h）DN32.D3 细胞中 CTSS 过表达。（j）CTSS 过表达 DN32.D3 细胞中的自噬/线粒体自噬标志物。（k）shRNA 介导敲低 CTSS 后，DN32.D3 细胞中 Ctss mRNA 表达。（m）、（n）shCTSS 表达或氯喹（CQ）处理 DN32.D3 细胞中 p62 的蛋白水平。（p）、（u）给药方式。（q）肝脏/体重比，以及血清 AST、ALT 和 ALP 水平。（s）胆汁酸稳态相关关键基因的 mRNA 表达。（t）FXR、CYP2B10、CTSS、p62、LC3I/II 和 PINK1 的蛋白水平。（v）ANIT 诱导胆汁淤积中的肝脏/体重比及血清 ALT 水平。（w）CTSS 的 mRNA 和蛋白水平。（y）CTSS 敲除小鼠中的血清 AST 和 ALT 水平。数据以均值 ± SEM 表示，n = 5–6；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与对照组相比； < 0.05，# < 0.01，## < 0.001，与 EE、ANIT、TCA 或 CEL 组相比。

CTSS 抑制促进 iNKT1 亚型极化

在 EE/ANIT 诱导的胆汁淤积中，Z-FL-COCHO 降低了肝脏 iNKT17 细胞比例，导致 iNKT1 亚型偏向（图 6a–d）。在共培养系统中，与 TCA 组相比，雷公藤红素和 Z-FL-COCHO 均增加了 DN32.D3 细胞 IFN-γ 分泌，并降低 IL-4 和 IL-17 分泌，提示其偏向 iNKT1 亚型（图 6e 和 f）。此外，氯喹消除了雷公藤红素诱导的 iNKT1 亚型偏向，说明自噬在雷公藤红素诱导 iNKT1 细胞极化中发挥关键作用（图 6g 和 h）。值得注意的是，CTSS 敲除使雷公藤红素诱导的 iNKT1 细胞极化转变为致病性 iNKT17 偏向（图 6i 和 j）。因此，CTSS-自噬轴可在胆汁淤积肝脏微环境中诱导保护性 iNKT1 偏向。

图 6｜CTSS 抑制促进 iNKT1 亚型偏向。
（a）、（c）、（e）、（g）和（i）活化 iNKT（CD69^+）细胞、IFN-γ^+ iNKT1、IL-4^+ iNKT2 和 IL-17^+ iNKT17 细胞亚群的比例。（b）、（d）、（f）、（h）和（j）iNKT1/iNKT2 与 iNKT1/iNKT17 比值。数据以均值 ± SEM 表示，n = 5；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与对照组相比； < 0.05，# < 0.01，## < 0.001，与 EE、ANIT、TCA 或 TCA + CEL 组相比。

雷公藤红素通过 CTSS-自噬-iNKT1 极化轴减轻 CCl4 诱导的肝纤维化和肝损伤

为评估雷公藤红素治疗其他肝病过程中 CTSS-自噬-iNKT1 极化轴的变化，我们采用了 CCl4 诱导的肝纤维化和急性肝损伤模型（图 7a 和 o）。雷公藤红素显著减轻急性和慢性肝损伤，表现为肝脏病理改善（图 7b 和 p），小鼠血清 AST 和 ALT 水平降低（图 7c 和 q），以及细胞上清液中 AST、ALT 和 LDH 水平降低（图 7r）。

在肝纤维化模型中，雷公藤红素减少了胶原沉积，表现为 Masson 三色染色和 Sirius Red 染色减弱（图 7d），以及血清 PC-III 和 HA 水平降低（图 7e）。雷公藤红素还下调了小鼠肝脏中纤维化相关基因（Acta2、Tgfb1、Col1a1 和 Col1a2）和纤维化相关蛋白（α-SMA、COL1A1）的表达（图 7f 和 g），并在 TGF-β 刺激的 LX-2 细胞中发挥相似作用（图 7h–j）。

雷公藤红素抑制了小鼠肝脏中的 CTSS 表达，并促进自噬（图 7k、l、s 和 u），也在共培养系统的 iNKT 细胞中发挥这一作用（图 7m、t 和 u）。来自肝硬化患者的临床单细胞 RNA 测序数据（GSE136103）也显示，NKT 细胞发生显著改变，并富集于 Th17 细胞分化、抗原加工与呈递以及 Th1 和 Th2 细胞分化通路（图 7n 上）。另一单细胞 RNA 测序数据集（GSE134037）证实，CCl4 处理小鼠 NKT 细胞中 CTSS 表达升高，同时 NKT 细胞发生改变，并富集于溶酶体生物发生、氧化磷酸化和自噬通路（图 7n 下）。因此，雷公藤红素通过抑制 CTSS 并恢复 iNKT 细胞中的自噬，减轻 CCl4 诱导的肝纤维化和急性肝损伤。

图 7｜雷公藤红素通过 CTSS-自噬-iNKT1 极化轴减轻 CCl4 诱导的肝纤维化和肝损伤。
（a）、（o）实验示意图。（b）、（p）肝脏切片 H&E 染色。（c）、（q）血清 AST 和 ALT 水平。（d）肝脏切片 Masson 三色染色和 Sirius Red 染色。（e）血清 PCIII 和 HA 水平。（f）肝脏 Acta2、Tgfb1、Col1a1 和 Col1a2 的 mRNA 表达。（g）、（j）α-SMA 和 COL1A1 的蛋白水平。（h）雷公藤红素在 LX-2 细胞中的细胞毒性。（i）ACTA2 和 COL1A1 的 mRNA 表达，以及（k）、（s）和（t）Ctss 的 mRNA 表达。（l）免疫组织化学检测，以及（m）Western blot 检测 CTSS、p62、Parkin 和 PINK1 蛋白。（n）对肝硬化患者和健康对照（CON，GSE136103）或 CCl4 与对照小鼠肝脏非实质细胞（GSE134037）进行 UMAP 分析；NKT 细胞 KEGG 富集通路分析，以及 NKT 细胞中 CTSS 表达（GSE134037）。（r）细胞上清液中的 AST、ALT 和 LDH 水平。（u）肝组织和 iNKT 细胞中 CTSS 和自噬标志物的蛋白水平。数据以均值 ± SEM 表示，n = 5；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与对照组相比； < 0.05，# < 0.01，## < 0.001，与 CCl4 或 TGF-β 组相比。

雷公藤红素在 CCl4 诱导的肝纤维化和肝损伤中促进 iNKT1 亚型偏向

炎症在推动胆汁淤积性肝损伤向肝纤维化进展中发挥重要作用。已有报道表明，iNKT 细胞在 CCl4 诱导的肝纤维化和急性肝损伤中具有保护作用，但肝纤维化发生过程中 iNKT1、iNKT2 和 iNKT17 亚群的具体变化仍不明确。

在肝纤维化和急性肝损伤的体内与体外模型中，雷公藤红素同样诱导了 iNKT1 亚型偏向（图 8a–d）。因此，雷公藤红素也在其他肝病模型中促进保护性 iNKT1 亚型偏向。iNKT1 细胞分泌的 IFN-γ 可抑制 HSC 活化和增殖。本研究结果为雷公藤红素抗纤维化作用提供了新的理论依据。

图 8｜雷公藤红素在 CCl4 诱导的肝纤维化和肝损伤模型中促进 iNKT1 亚型偏向。
（a）纤维化模型中活化（CD69^+）iNKT 细胞、iNKT1、iNKT2、iNKT17 细胞亚群的比例，以及 iNKT1/iNKT2、iNKT1/iNKT17 比值；（b）共培养系统中 iNKT 细胞的相应结果。（c）急性肝损伤模型中的相应 iNKT 细胞谱系变化；（d）共培养系统中 iNKT 细胞的相应变化。（e）图形摘要。数据以均值 ± SEM 表示，n = 5；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与对照组相比； < 0.05，# < 0.01，## < 0.001，与 CCl4 或 TGF-β 组相比。

【Citation】:Wang H, Yang M, Zhang S, Mai M, Mei Y, Zhang Y, Zhang L, Liu J, Xing M, Wang X. 2026. Celastrol ameliorates cholestatic liver injury by promoting a protective iNKT1 polarization via CTSS inhibition and autophagy restoration.Targetome2(2): e016.

【贡献】★★★★★

综上，雷公藤红素靶向并抑制 CTSS，增强自噬/线粒体自噬，促进保护性 iNKT1 细胞偏向，从而减轻胆汁淤积性肝损伤和纤维化。CTSS 的遗传性消除或药理性抑制，以及使用氯喹药理性阻断自噬流，均消除了雷公藤红素诱导的 iNKT1 极化和肝保护作用，证实 CTSS 依赖的自噬/线粒体自噬增强是雷公藤红素发挥免疫调节作用的关键机制。

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