Acta Pharmacol Sin I 天然植物甾醇发力：β-谷甾醇激活脂滴自噬，精准清除MASH肝脏脂毒性 (孙慧君-大连医科大学)

2026年1月7日，大连医科大学药学院临床药理学教研室孙慧君团队 在Acta Pharmacologica Sinica （中科院2区，IF=8.4）在线发表题为 “β-Sitosterol ameliorates metabolic dysfunction-associated steatohepatitis by targeting the RAC1/mTOR/TFEB axis thus activating lipophagy-lysosomal pathway” 的研究论文。该研究聚焦代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）这一代谢性肝病关键问题，围绕天然植物甾醇 β-谷甾醇（β-Sitosterol，β-SIT）改善肝脏脂质蓄积、脂滴自噬障碍和溶酶体功能损伤的作用及机制展开系统研究。

研究团队采用胆碱缺乏、L-氨基酸限定高脂饮食（CDAHFD）和高脂饮食（HFD）分别构建小鼠 MASH 模型，并结合游离脂肪酸诱导的AML-12和HepG2肝细胞脂质过载模型，从体内外多层面验证 β-SIT 的治疗作用。结果显示，β-SIT 可显著降低肝组织 TG 水平，改善血脂谱，减轻肝细胞脂肪变性、炎症细胞浸润和肝纤维化，并降低血清 ALT、AST 水平，提示其具有明确的抗 MASH 和肝保护作用。

机制上，该研究发现，β-SIT 并非单纯通过抑制脂肪酸合成发挥作用，而是主要通过增强脂肪酸 β 氧化、促进脂滴降解和激活脂滴自噬来恢复肝脏脂质稳态。进一步研究表明，β-SIT 可增强自噬流，促进溶酶体生物发生，并加强溶酶体与脂滴之间的相互作用，从而推动脂滴进入溶酶体降解通路，清除肝细胞内异常堆积的脂滴。

值得关注的是，研究通过生物信息学预测、分子对接、分子动力学模拟和细胞热转变实验确认RAC1 是 β-SIT 的直接作用靶点。β-SIT 通过靶向 RAC1，抑制 mTOR 通路过度激活，并促进 TFEB 核转位，进而恢复脂滴自噬-溶酶体通路功能。RAC1 过表达可明显削弱 β-SIT 对脂滴清除、自噬流恢复和 MASH 改善的作用，而 RAC1 敲低则进一步增强 β-SIT 的保护效应，证实 RAC1 是其发挥作用的关键节点。

此外，该研究进一步揭示，β-SIT 可破坏溶酶体膜上 RAC1 与 mTOR 的异常相互作用，降低溶酶体局部 p-mTOR 水平，解除 mTOR 对 TFEB 的抑制，使 TFEB 入核并启动溶酶体生物发生和自噬相关基因表达。由此，β-SIT 可从“靶向 RAC1—抑制 mTOR—激活 TFEB—重启脂滴自噬”这一连续机制链条上修复 MASH 中受损的脂质清除系统。

该研究系统阐明了 β-谷甾醇通过 “RAC1/mTOR/TFEB 轴—脂滴自噬—溶酶体通路” 改善 MASH 的新机制，为天然植物活性成分干预代谢性脂肪性肝炎提供了新的实验依据，也为靶向脂滴自噬-溶酶体功能障碍治疗 MASH 提供了重要思路。

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【摘 要】

代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）是代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MAFLD）的一种炎症性亚型，可导致肝功能异常，并造成严重健康负担。脂滴自噬功能障碍会破坏脂滴降解并诱导溶酶体损伤，与 MASH 进展密切相关。因此，靶向激活脂滴自噬-溶酶体通路已成为治疗 MASH 的一种有前景策略。

β-谷甾醇（β-sitosterol，β-SIT）来源于水蓼（Polygonum hydropiper L.），其结构与胆固醇相似，并具有神经保护、抗糖尿病和抗肥胖等生物活性。本研究探索了 β-SIT 治疗 MASH 的潜力。

研究分别采用胆碱缺乏、L-氨基酸限定高脂饮食（CDAHFD）喂养 10 周，或高脂饮食（HFD）喂养 12 周，建立 MASH 小鼠模型。体外实验中，采用游离脂肪酸混合物处理 AML-12 细胞，以模拟脂质过载状态。MASH 小鼠每日灌胃给予 β-SIT 10 或 20 mg/kg，持续 10 周。

结果显示，β-SIT 通过增强体内外脂滴自噬-溶酶体通路，以剂量依赖方式缓解 MASH。在 FFA 刺激的 AML-12 细胞中，β-SIT 20 μM 可激活自噬流、促进溶酶体生物发生，并增强溶酶体与脂滴之间的相互作用。这些结果通过透射电镜、多结构光照明显微镜实时荧光监测以及脂滴自噬相关标志物检测得到证实。

通过生物信息学、分子动力学模拟、细胞热转变实验（CETSA）和功能实验等综合方法，研究发现 β-SIT 可通过直接靶向 Ras 相关 C3 肉毒毒素底物 1（RAC1），抑制 MASH 小鼠中 mTOR 通路激活。进一步通过成像/三维重建、共免疫沉淀、免疫荧光共定位、溶酶体分离和生化分析，研究证实 β-SIT 可调控 FFA 刺激 AML-12 细胞中溶酶体上的 RAC1/mTOR 相互作用，从而恢复脂滴自噬功能。

关键的是，β-SIT 通过调控 RAC1-mTOR 轴，促进转录因子 EB（TFEB）核转位，进而修复脂滴自噬-溶酶体缺陷并减轻 MASH 进展。研究结果提示，靶向 RAC1-mTOR-TFEB 轴是 β-SIT 调控脂滴自噬-溶酶体功能的新机制，并支持 β-SIT 作为 MASH 治疗候选药物的潜力。

关键词:代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎；β-谷甾醇；RAC1；mTOR；TFEB；脂滴自噬-溶酶体通路

01

研究背景及科学问题

生活方式改变导致代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）患病率显著升高，其中多达 30% 的患者会进展为代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）。MASH 以肝脂肪变性、炎症和纤维化为主要特征，最终可能进展为肝硬化和肝细胞癌，因此带来严重公共卫生负担。

目前，MASH 的治疗主要依赖生活方式干预以及间接作用药物，如降脂药和保肝药。然而，患者长期依从性较差，加之现有治疗对阻止疾病进展的效果有限，提示亟需开发针对 MASH 发病机制的药物。

近年来，天然植物活性成分因疗效显著、副作用较低而受到广泛关注，被认为是 MASH 治疗的重要突破口。β-谷甾醇是一种与胆固醇结构相似的植物甾醇，已有研究报道其具有神经保护、抗氧化、抗糖尿病、抗肥胖和抗炎等作用，这些药理活性与代谢综合征相关疾病的治疗靶点高度契合。然而，β-SIT 改善 MASH 的机制仍不清楚。因此，本研究探讨 β-SIT 减轻肝脏脂质代谢紊乱及脂滴蓄积导致 MASH 的治疗潜力。

大脂滴自噬，以下简称脂滴自噬，是哺乳动物细胞选择性自噬脂滴的关键保守机制。在该过程中，自噬囊泡首先包裹脂滴，随后与溶酶体融合，使脂质被酶促降解。慢性高脂饮食或 CDAHFD 诱导的肝细胞脂质过度沉积会破坏自噬体-溶酶体融合，阻断自噬流并加重溶酶体损伤，从而共同推动 MASH 和代谢综合征进展。

持续性脂滴聚集不仅启动 MAFLD/MASH 的发生，还会通过自我强化循环持续加重肝细胞损伤。已有实验提示，如果不能解决自噬受损导致的脂肪变性和脂滴堆积，MASH 进展很难逆转。本研究发现 β-SIT 可显著抑制脂滴沉积并强效诱导脂滴自噬，为理解 β-SIT 改善 MASH 的分子机制提供了关键线索。

基于上述发现，研究进一步通过生物信息学数据库预测发现，RAC1 可能是 β-SIT 改善 MASH 中脂滴自噬失调的关键介导分子。RAC1 是调控自噬的重要信号转导分子，具有双重作用：一方面可激活 mTOR 信号通路，另一方面可直接抑制自噬体-溶酶体融合，从而抑制自噬流。机制上，RAC1 与 mTORC1 可共同定位于溶酶体膜上，RAC1 可与 mTOR 发生物理结合并调节其活性。

此外，RAC1 过度激活还可通过促进脂质沉积、抑制脂肪酸 β 氧化、诱导肝星状细胞介导的纤维化等多条途径加重 MASH 病程。因此，靶向 RAC1 驱动的脂滴自噬失调，可能是阻断 MASH 进展的重要治疗策略。

进一步机制研究显示，RAC1 激活的 mTOR 信号可抑制 TFEB。TFEB 是溶酶体生物发生和脂质代谢的主调控因子，对脂滴自噬终末步骤至关重要。在营养充足条件下，mTORC1 通过磷酸化将 TFEB 滞留于胞质中，从而抑制其转录活性。TFEB 可通过激活溶酶体酶、调节过氧化物酶体通路、增强脂滴自噬介导的脂滴降解等方式协调脂质稳态，而这些过程在 MASH 中均明显受损。

本研究证明，RAC1 可通过整合 mTOR-TFEB 信号轴调控溶酶体功能，而 β-SIT 能够特异性靶向 RAC1-mTOR-TFEB 轴，在小鼠和肝细胞中恢复脂滴自噬功能。这些发现不仅提示 β-SIT 具有作为 MASH 治疗候选药物的潜力，也为靶向脂滴自噬-溶酶体通路改善肝脏脂质蓄积提供了机制基础。

02

重要发现及亮点

1. β-SIT 减轻 FFA 诱导肝细胞脂质蓄积

为考察 β-SIT 在体外对 MASH 的治疗作用，研究采用游离脂肪酸混合物处理 AML-12 细胞，以模拟脂质过载状态。CCK-8 实验显示，无论是否存在 FFA，即使 β-SIT 浓度达到 40 μM，也未表现出明显细胞毒性。

油红 O 和 BODIPY493/503 染色显示，FFA 诱导可使 AML-12 细胞脂滴增大并发生脂质蓄积，而不同剂量 β-SIT 或阳性药物瑞舒伐他汀均可显著逆转这些变化。细胞 TG 和 TC 水平检测显示，20 μM β-SIT 的降脂效果与瑞舒伐他汀相近。研究在 FFA 处理的 HepG2 细胞中重复关键实验，也得到相似结果：β-SIT 可降低脂滴蓄积、改善脂肪变性，并降低 TC 和 TG 水平，同时不影响细胞活力。以上结果表明，β-SIT 具有显著降脂作用。

进一步检测脂质代谢相关蛋白发现，β-SIT 下调脂滴相关蛋白 PLIN2 表达，同时上调脂肪酸氧化关键调控蛋白 PPARα 和 CPT1α，其效果与瑞舒伐他汀相当。这提示 β-SIT 可能通过促进脂滴分解和脂肪酸 β 氧化减少肝细胞脂质沉积。

此外，β-SIT 还下调脂肪酸合成相关蛋白 ACC1、SREBP1 和 SCD1，但其对脂肪酸合成的抑制作用略弱于瑞舒伐他汀。总体来看，β-SIT 主要通过增强脂肪酸氧化、促进脂解和抑制脂滴蓄积改善脂质代谢。综合不同浓度效果，20 μM β-SIT 在抑制脂滴沉积、降低 TG/TC 水平和促进脂滴降解方面作用最强，因此后续实验选用该浓度。

图1 β-SIT 改善 FFA 诱导的体外脂质沉积。
A：β-SIT 的化学结构；
B、C：β-SIT 在有或无 FFA 条件下对 AML-12 细胞活力的影响；
D：采用油红 O 和 BODIPY493/503 染色观察脂滴聚集，比例尺：10 μm；
E：油红 O 阳性面积定量分析；
F：BODIPY493/503 荧光强度定量，并按细胞面积进行体积归一化；
G、H：检测 10、20、40 μM β-SIT 以及 5 μM 阳性药物瑞舒伐他汀对 TG 和 TC 的影响；
I、J：检测 CPT1α、PPARα 和 PLIN2 蛋白表达变化；
K、L：检测 ACC1、SREBP1 和 SCD1 蛋白表达变化。
数据以均数 ± SEM 表示。采用单因素方差分析。**P<0.01，***P<0.001 vs. 对照组；<0.05，#<0.01 vs. FFA 模型组；n.s. 表示无显著差异。

2. β-SIT 减轻 CDAHFD 和 HFD 诱导的小鼠 MASH

CDAHFD 饮食可在 C57BL/6 小鼠中快速诱导 MASH 病变，并导致明显体重下降。为评估 β-SIT 疗效，研究设置六个实验组。连续 10 周 β-SIT 干预后，高剂量 β-SIT 可减轻 CDAHFD 诱导的体重下降，降低肝脏/体重比，且不影响食物摄入。

β-SIT 还降低肝脏 TG 水平，并改善 CDAHFD 小鼠血清脂质谱。肝脏大体形态、H&E 染色、油红 O 染色、Masson 染色和 F4/80 免疫荧光染色共同证实，高剂量 β-SIT 可显著缓解 CDAHFD 诱导的肝脂肪变性、纤维化和免疫细胞浸润。NAFLD 活动评分进一步提示，高剂量 β-SIT 的疗效与阳性对照瑞舒伐他汀相当。

血清生化检测显示，β-SIT 显著降低 MASH 模型小鼠 AST 和 ALT 水平，提示其可有效减轻肝损伤。值得注意的是，β-SIT 不改变血清肌酐和尿素氮水平，说明其未表现出明显肾毒性，安全性较好。

在 CDAHFD 小鼠肝组织中，β-SIT 上调 PPARα 和 CPT1α 表达，下调 PLIN2 表达，提示其可改善脂质代谢紊乱并促进脂解。同时，β-SIT 下调 ACC1、SREBP1 和 SCD1 等脂肪酸合成蛋白，但其抑制脂肪酸合成的作用弱于瑞舒伐他汀。整体而言，体内结果与体外结果一致，表明 β-SIT 主要通过促进脂质分解代谢，包括脂肪酸氧化和脂滴降解，而非主要依赖抑制脂肪酸合成来改善 MASH。

为弥补 CDAHFD 模型胆碱缺乏的局限，研究进一步在传统 HFD 模型中验证 β-SIT 疗效。HFD 喂养小鼠并给予 β-SIT 20 mg/kg 干预 12 周后，β-SIT 仍可显著降低体重、肝脏/体重比和附睾白色脂肪组织重量，同时改善肝脏 TG 含量、血清 AST/ALT 和血脂谱。组织学分析显示，β-SIT 可缓解 HFD 小鼠肝细胞气球样变、细胞肿胀和坏死，同时减轻肝纤维化、免疫细胞浸润和脂滴蓄积。此外，β-SIT 还可减小脂肪细胞面积，改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，并恢复脂肪酸氧化和脂滴相关蛋白表达。以上结果说明，β-SIT 在 CDAHFD 和 HFD 两种 MASH 小鼠模型中均可减轻肝脂肪变性并恢复脂质代谢稳态。

图2 β-SIT 改善 CDAHFD 和 HFD 饮食诱导的小鼠 MASH。
A：研究设计。采用 CDAHFD 建立 MASH 模型，并给予低剂量 β-SIT（10 mg/kg）、高剂量 β-SIT（20 mg/kg）和阳性对照瑞舒伐他汀（20 mg/kg）干预 10 周后分析，n=8；
B：肝脏重量/体重比；
C：小鼠肝脏 TG 含量；
D：小鼠血清 TG、TC、LDL、HDL 水平；
E–I：肝脏大体形态、H&E 染色、油红 O 染色、Masson 染色和 F4/80 阳性免疫荧光，以及 NAS 评分和组织学评价；
J、K：小鼠血清 ALT 和 AST 水平；
L、M：不同组小鼠肝组织中 CPT1α、PPARα 和 PLIN2 蛋白表达变化。
原始放大倍数 ×40，比例尺：50 μm，局部放大图 20 μm；肝脏比例尺：1 cm。数据以均数 ± SEM 表示。**P<0.01，***P<0.001 vs. 对照组；<0.05，#<0.01 vs. CDAHFD 模型组；n.s. 表示无显著差异。

3. β-SIT 通过增强自噬流和恢复脂滴自噬，改善 FFA 诱导的肝细胞脂质蓄积

过量 FFA 会导致肝细胞脂滴堆积。脂滴自噬可通过调节脂肪酸氧化和分解代谢促进脂滴降解，从而维持脂质稳态。前述结果显示，β-SIT 可抑制脂滴沉积并促进脂解，因此研究进一步探讨 β-SIT 是否通过激活脂滴自噬和增强自噬流减少脂质蓄积。

在 FFA 刺激的肝细胞中，与 BSA 组相比，自噬标志物 LC3B-II 蛋白表达显著下降，自噬底物 p62 表达升高。同时，ATG5、ATG7 和 Beclin-1 等自噬相关蛋白表达下调。而 β-SIT 干预可逆转上述变化，提示 β-SIT 可对抗 FFA 诱导的自噬溶酶体降解障碍或自噬流受损，从而改善脂质蓄积。

为探讨 β-SIT 增强自噬流的机制，研究将mCherry-eGFP-LC3B质粒转染入细胞。超分辨率显微镜观察显示，FFA 诱导的肝细胞中脂滴明显堆积，同时溶酶体数量减少、亚细胞超微结构受损。β-SIT 处理后，溶酶体数量明显增加，脂滴沉积减轻。荧光成像分析显示，FFA 处理细胞中黄色荧光点增加、单红色荧光信号减少，提示自噬流受损；β-SIT 处理后红色荧光点明显增加，说明受阻的自噬流得到恢复。

为进一步验证该作用，研究使用氯喹阻断自噬体与溶酶体融合，并通过计算净 LC3B-II 流评估自噬流。Western blot 结果显示，FFA 处理后净 LC3B-II 流显著下降，而 β-SIT 可明显逆转该变化；但氯喹可拮抗 β-SIT 的有益作用。BODIPY493/503 染色也证实，β-SIT 可改善 FFA 诱导的脂质蓄积，而氯喹可抵消这一作用。这些结果说明，β-SIT 通过恢复自噬流和促进脂滴自噬减轻肝脂肪变性。

进一步检测 LAMP1 免疫荧光发现，FFA 暴露显著减少溶酶体数量并损害溶酶体功能，而 β-SIT 不仅逆转这些变化，还恢复溶酶体完整性。为观察溶酶体与脂滴的相互作用，研究采用超分辨率显微镜追踪活细胞中溶酶体和脂滴的空间关系。结果显示，β-SIT 显著增强溶酶体与脂滴的共定位，并可见溶酶体膜包裹脂滴。

时间延迟成像进一步显示，β-SIT 处理 0 h 时，脂滴与溶酶体之间几乎无明显共定位或相互作用；处理 12 h 后，出现明显溶酶体募集和两种细胞器之间的瞬时接触；处理 24 h 后，溶酶体与脂滴的相互作用明显增强，共定位更加突出。总体表明，β-SIT 可通过增强自噬流、激活脂滴自噬以及加强脂滴-溶酶体相互作用改善脂质沉积。

图3 β-SIT 激活 FFA 处理肝细胞中的自噬流和脂滴自噬。
A–D：Western blot 检测 FFA 诱导肝细胞经 β-SIT 处理后 LC3B-II、p62、PLIN2、ATG5、ATG7 和 Beclin-1 蛋白水平；
E、F：转染 mCherry-GFP-LC3B 质粒的 AML-12 细胞用于评估自噬流，并展示代表性图像。黄色点代表自噬囊泡，红色点代表自噬溶酶体；
G、H：AML-12 细胞经 β-SIT 预处理 24 h，并在有或无氯喹条件下检测净 LC3B-II 流；
I、J：BODIPY493/503 染色观察有或无氯喹条件下脂滴聚集；
K、L：LAMP1 免疫荧光染色代表图像及定量分析；
M：BODIPY493/503 标记脂滴，LysoTracker Red 标记溶酶体，采用多结构光照明显微镜拍摄明场和荧光图像，并生成 3D 表面图显示荧光图像；
N：多结构光照明显微镜对 β-SIT 干预 0、12、24 h 进行 7 min 时间延迟成像，显示脂滴与溶酶体接触的动态和瞬时特征。
比例尺：10 μm，局部放大图 1 或 5 μm。数据以均数 ± SEM 表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n.s. 表示无显著差异。

4. β-SIT 通过恢复脂滴自噬活性，改善 MASH 小鼠肝脏脂质蓄积

为研究 β-SIT 在体内对脂滴自噬的影响，研究在 CDAHFD 喂养小鼠中进行了系统分析。与模型组相比，β-SIT 显著增强自噬和溶酶体生物发生，表现为自噬标志物 LC3B-II、溶酶体标志物 LAMP1 表达升高，p62 表达降低。

同时，β-SIT 明显降低肝组织 PLIN2 蛋白表达，并增强 LAMP1 荧光信号，二者共定位增加，提示脂滴自噬被强烈激活。透射电镜显示，CDAHFD 模型小鼠肝组织中脂滴增大，自噬体无法与溶酶体融合，提示自噬溶酶体形成受阻；而 β-SIT 处理可促进自噬体包裹脂滴，并通过自噬溶酶体形成促进脂滴降解。与 CDAHFD 模型一致，在 HFD 模型中，β-SIT 同样可调控自噬并激活自噬溶酶体形成。

为确认 β-SIT 的肝保护作用确实依赖自噬机制，研究使用氯喹处理小鼠建立自噬缺陷环境。结果显示，氯喹阻断了 β-SIT 在 CDAHFD 小鼠中的降脂作用，并逆转了 β-SIT 促进 PLIN2 与 LAMP1 共定位的效果，削弱脂滴自噬激活。以上结果证明，β-SIT 对 MASH 的保护作用依赖自噬介导的脂滴自噬调控。

图4 β-SIT 通过激活脂滴自噬改善 MASH 小鼠脂肪变性。
A：CDAHFD 诱导 MASH 模型小鼠不同组肝组织中 LC3B、p62 和 LAMP1 蛋白表达变化；
B：肝组织切片中 PLIN2（绿色）和 LAMP1（红色）的双重免疫荧光，黄色区域表示荧光共定位，DAPI 复染细胞核；
C：小鼠肝组织透射电镜图像。黄色代表溶酶体，红色代表自噬溶酶体，绿色代表自噬囊泡，蓝色代表脂滴；
D：研究设计。采用 CDAHFD 建立 MASH 模型并给予高剂量 β-SIT（20 mg/kg）干预，氯喹从第 6 周开始腹腔注射，第 10 周分析；
E：小鼠肝组织 H&E 染色和油红 O 染色；
F：肝脏 TG 含量；
G：肝组织中 PLIN2（绿色）和 LAMP1（红色）的双重免疫荧光。
比例尺：50 μm，局部放大图 20 μm；透射电镜比例尺：1 μm，局部放大图 200 nm。数据以均数 ± SEM 表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n.s. 表示无显著差异。

5. β-SIT 在体外通过靶向 RAC1 促进脂滴自噬

为进一步探讨 β-SIT 如何通过调节脂滴自噬促进脂解，研究首先通过多数据库综合生物信息学分析筛选潜在分子靶点。研究整合三个 MASH GEO 数据集，共包括 46 个 MASH 样本和 45 个对照样本，并识别出 909 个差异表达基因。随后，将这些差异基因与 232 个自噬相关基因交叉分析，得到 13 个重叠基因，并通过 LASSO 回归筛选出 11 个关键诊断基因。ROC 曲线分析显示这些基因具有较好的判别能力。

随后，研究整合 Batman、SuperPred、Swiss Target Prediction 和 PharmMapper 数据库预测 β-SIT 潜在靶点，并与 11 个关键诊断基因取交集，最终确定 RAC1 是 β-SIT 通过自噬调控 MASH 的预测靶点。分子对接显示，β-SIT 与 RAC1 的结合能为 −7.5 kcal/mol，提示二者具有较强相互作用。分子动力学模拟进一步显示 β-SIT-RAC1 复合物逐渐稳定，形成稳定结合构象。细胞热转变实验显示，β-SIT 可提高 RAC1 在 37–70°C 范围内的热稳定性，进一步证实 RAC1 是 β-SIT 的直接靶点。Western blot 结果显示，β-SIT 可显著抑制 FFA 诱导的 RAC1 蛋白上调。

由于抑制 mTOR 通路是激活自噬的经典机制，且 RAC1 抑制可调控 mTOR 信号增强自噬，研究进一步探讨 β-SIT 是否通过 RAC1-mTOR 通路调节自噬流和脂滴自噬。结果显示，β-SIT 显著降低 FFA 诱导 AML-12 细胞中 RAC1 和 p-mTOR 蛋白表达，提示 β-SIT 可能通过下调 RAC1 抑制 mTOR 通路激活。

为验证 RAC1 在脂滴自噬中的调控作用及其是否参与 β-SIT 增强自噬流、减轻脂质沉积，研究在 AML-12 细胞中进行 RAC1 过表达和敲低。基础状态下，RAC1 过表达促进细胞脂质蓄积并阻断自噬流，提示 RAC1 过表达会损害脂滴自噬清除。FFA 条件下，RAC1 过表达抑制 LC3B-II 表达，上调 PLIN2、p62 和 p-mTOR，说明 RAC1 过表达通过激活 mTOR 通路抑制自噬溶酶体形成，最终导致脂滴蓄积和代谢紊乱。

相反，RAC1 敲低可强效抑制 mTOR 通路活性，促进自噬流并恢复脂质稳态。β-SIT 可降低 RAC1 蛋白水平并抑制 mTOR 磷酸化，同时激活脂滴自噬，表现为 LC3B-II 上调、p62 和 PLIN2 下调；这些作用在 RAC1 过表达细胞中明显减弱，而在 RAC1 敲低细胞中进一步增强。

油红 O 染色、细胞 TG 含量和 mCherry-eGFP-LC3B 实验结果均显示，β-SIT 可显著增强自噬流、减少脂滴蓄积和溶酶体损伤；RAC1 过表达阻断 β-SIT 的保护作用，导致自噬流形成受阻和脂质蓄积；RAC1 敲低则增强 β-SIT 的作用。溶酶体和脂滴定位分析显示，β-SIT 可增强脂滴与溶酶体共定位，促进溶酶体包裹脂滴；RAC1 过表达抑制这种共定位并削弱 β-SIT 疗效，而 RAC1 敲低增强该作用。

综上，β-SIT 可调控 RAC1-mTOR-自噬轴，通过增强自噬体形成和促进溶酶体生物发生两个连续机制激活脂滴自噬，从而改善脂质代谢紊乱。

图5 β-SIT 通过调控 RAC1 表达调节脂滴自噬。
A：Venn 图显示 MASH 疾病差异相关基因、β-SIT 预测靶点和自噬数据库共有重叠基因；
B：β-SIT 与 RAC1 的分子对接，结合能 = −7.5 kcal/mol；
C：分子动力学模拟中 β-SIT-RAC1 复合物 RMSD 值变化及可视化结果；
D：肝细胞中 RAC1 的细胞热转变实验；
E：Western blot 检测 β-SIT 诱导的 RAC1、mTOR 和 p-mTOR 蛋白表达变化；
F：AML-12 细胞转染 oeRAC1 或 oeCon 后，经 FFA 和 β-SIT 处理 24 h，检测 p62、LC3B、PLIN2、mTOR、p-mTOR 和 RAC1 蛋白；
G、H：Vehicle、oeRAC1 和 siRAC1 组油红 O 染色及阳性面积定量；
I：细胞内 TG 含量；
J、K：转染 mCherry-GFP-LC3B 质粒后，在有或无 vehicle、oeRAC1 和 siRAC1 条件下分析自噬流；黄色点表示自噬囊泡，红色点表示自噬溶酶体；
L：脂滴和溶酶体分别用 BODIPY493/503 和 LysoTracker Red 标记，并在有或无 β-SIT 处理下观察 vehicle、oeRAC1 和 siRAC1 组。
比例尺：10 或 20 μm，局部放大图 1 或 5 μm。数据以均数 ± SEM 表示。*P<0.05，**P<0.01；n.s. 表示无显著差异。

6. β-SIT 在体内通过靶向 RAC1 促进脂滴自噬

基于细胞实验结果，研究进一步评估 β-SIT 是否在小鼠中通过靶向 RAC1 促进脂滴自噬来减轻 MASH。Western blot 显示，CDAHFD 和 HFD 诱导小鼠中 RAC1 蛋白表达均上调，并伴随 mTOR 通路激活，而 β-SIT 可显著逆转这一变化。

为验证 RAC1 的关键作用，研究采用尾静脉注射 AAV8-RAC1，在正常饮食和 CDAHFD 小鼠中诱导肝脏 RAC1 过表达。正常饮食小鼠中，肝脏 RAC1 过表达并未导致明显肝损伤，但油红 O 染色显示出现轻度脂滴蓄积，Western blot 进一步提示该表型可能与自噬受损有关。

在 CDAHFD 小鼠中，肝组织 TG 检测和血脂分析显示，RAC1 过表达显著抑制 β-SIT 改善血脂异常和降低肝脏 TG 的治疗作用。肝脏大体形态、H&E 染色、油红 O 染色、Masson 染色和 F4/80 免疫荧光结果显示，RAC1 过表达进一步加重 CDAHFD 诱导的肝脂肪变性，导致细胞肿胀、坏死以及肝内脂滴体积和数量增加，并显著削弱 β-SIT 疗效。

透射电镜显示，RAC1 过表达小鼠肝脏中脂滴更大，自噬体形成受损，自噬溶酶体缺失，导致脂滴堆积；β-SIT 可促进溶酶体生物合成和脂滴自噬，但其促进自噬溶酶体形成及吞噬脂滴的作用被 RAC1 过表达削弱。免疫荧光共定位和 Western blot 进一步证实，β-SIT 诱导自噬溶酶体吞噬脂滴的作用受到 RAC1 过表达明显抑制。与此同时，RAC1 过表达也拮抗 β-SIT 下调 p-mTOR 和激活经典自噬通路的作用。

总之，β-SIT 通过激活脂滴自噬改善 MASH 的治疗作用高度依赖 RAC1，说明 RAC1 是关键治疗靶点。

图6 肝脏 RAC1 过表达可逆转 β-SIT 对 MASH 的改善作用。
A–D：CDAHFD 和 HFD 诱导的 MASH 小鼠模型中，β-SIT 处理后 RAC1、mTOR 和 p-mTOR 蛋白表达变化；
E：研究设计。采用 CDAHFD 建立 MASH 模型，并注射 AAV8-RAC1 腺相关病毒进行过表达，持续 10 周；
F：小鼠肝脏 TG 含量；
G：小鼠血清 TG 和 TC 水平；
H–L：小鼠肝脏大体形态、H&E 染色、油红 O 染色、Masson 染色和 F4/80 阳性免疫荧光，以及 NAS 评分和组织学评价；
M：小鼠肝组织透射电镜代表图像。黄色代表溶酶体，红色代表自噬溶酶体，绿色代表自噬囊泡，蓝色代表脂滴；
N：肝组织切片中 PLIN2（绿色）和 LAMP1（红色）的双重免疫荧光；
O、P：RAC1 过表达对 β-SIT 处理 MASH 小鼠蛋白水平的影响，包括 LC3B、p62、LAMP1、PLIN2、RAC1、mTOR 和 p-mTOR。
比例尺：50 μm，局部放大图 20 μm；肝脏比例尺：1 cm；透射电镜比例尺：1 μm，局部放大图 200 nm。数据以均数 ± SEM 表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n.s. 表示无显著差异。

7. β-SIT 通过破坏溶酶体上 RAC1-mTOR 相互作用调节溶酶体功能

mTOR 激活可从多个层面抑制自噬溶酶体功能，包括负向调控自噬起始、损害溶酶体生物发生，以及破坏自噬体-溶酶体融合。为深入理解 β-SIT 调节自噬溶酶体功能的作用，研究进一步探索 β-SIT 对溶酶体内 RAC1 和 mTOR 相互作用及定位的影响。

共免疫沉淀实验显示，FFA 处理促进 AML-12 细胞中 RAC1 与 mTOR 结合，而 β-SIT 显著减弱这种相互作用。免疫荧光分析进一步证实，FFA 诱导细胞中 RAC1 与 mTOR 共定位显著增强，而 β-SIT 可明显破坏二者共定位。因此，研究推测 β-SIT 可通过抑制 RAC1 和 mTOR 共定位来促进自噬及相关溶酶体功能。

mTORC1 定位于溶酶体膜上，直接调控溶酶体功能。既往研究显示，抑制 RAC1 与 mTOR 在溶酶体膜上的共定位，可促进溶酶体和自噬体合成，从而激活自噬。免疫荧光结果显示，FFA 诱导促进 RAC1 与溶酶体标志物 LAMP1 共定位，并削弱溶酶体对脂滴的包裹，导致脂滴降解减少和异常蓄积。β-SIT 处理则减少 FFA 诱导的 RAC1 与 LAMP1 共定位，同时激活溶酶体生成，增加能够包裹脂滴的溶酶体数量，从而促进脂滴降解。

三维重建结果与二维成像一致，进一步证实 β-SIT 可在空间上使 RAC1 从溶酶体上解离，使溶酶体能够更好地与脂滴接触。研究分离溶酶体组分后发现，RAC1 可定位于溶酶体；β-SIT 可降低溶酶体中 RAC1 水平，而 RAC1 过表达可拮抗 β-SIT 作用。溶酶体中 p-mTOR 含量变化与 RAC1 完全一致：β-SIT 抑制 p-mTOR 在溶酶体中的定位，而 RAC1 过表达可逆转这一现象。

总体而言，FFA 诱导的脂质紊乱模型中，溶酶体内 RAC1 与 mTOR 相互作用显著增强；β-SIT 可抑制二者在溶酶体中的相互作用，从而激活溶酶体生物发生，促进自噬溶酶体合成和脂滴吞噬。这一机制凸显了 β-SIT 解决 MASH 相关脂质蓄积的治疗潜力。

图7 β-SIT 通过抑制 RAC1 与 mTOR 在溶酶体上的共定位调节溶酶体功能。
A：AML-12 细胞经 FFA 和 β-SIT 处理 24 h 后，细胞裂解液进行 RAC1 抗体共免疫沉淀，并通过 Western blot 检测 mTOR 和 RAC1，以验证 RAC1 与 mTOR 的相互作用；
B：FFA 诱导 24 h 后，AML-12 细胞在有或无 β-SIT 处理下进行 RAC1（红色）和 mTOR（绿色）免疫荧光染色，并用多结构光照明显微镜分析，共定位显示为黄色；
C：代表性免疫荧光共染图。左图显示 RAC1（绿色）、LAMP1（红色）、脂滴 BODIPY493/503（亮蓝色）和 DAPI（蓝色）；中图显示 LAMP1 与脂滴共定位；右图显示 LAMP1 与 RAC1 定位；
D：超分辨率 z-stack 图像的三维表面模型重建，显示 LAMP1 标记溶酶体（红色）、脂滴（亮蓝色）和 RAC1（绿色）。白色箭头表示 RAC1-LAMP1 共定位但与脂滴分离，粉色箭头表示 LAMP1-脂滴关联但与 RAC1 分离；
E：采用溶酶体分离试剂盒从 AML-12 细胞分离溶酶体，检测全细胞裂解液和溶酶体裂解液中 RAC1、LAMP1、β-actin 和 Histone H3 水平；
F、G：AML-12 细胞转染空载体或 RAC1 过表达质粒后，经 FFA 及有或无 β-SIT 处理 24 h，提取溶酶体并检测 RAC1、mTOR、p-mTOR 和 LAMP1 水平。
比例尺：10 μm，局部放大图 1 或 2 μm。数据以均数 ± SEM 表示。*P<0.05，**P<0.01；n.s. 表示无显著差异。

8. β-SIT 通过调节 RAC1-mTOR 通路促进 TFEB 核转位

TFEB 是调控溶酶体生物发生和自噬的关键转录因子，在促进脂滴自噬和维持细胞内脂质稳态方面发挥重要作用。抑制溶酶体上 mTORC1 激活可促进 TFEB 核转位，从而启动自噬溶酶体生物合成及自噬相关基因表达。

为探讨 β-SIT 是否通过经典 RAC1-mTOR 通路调控 TFEB 核转位，研究观察了 TFEB 的亚细胞定位。在 FFA 处理肝细胞中，核内 TFEB 及其下游靶点 ATP6V1A、PGC1α 的表达水平均下降，而 β-SIT 可逆转这些变化，提示 β-SIT 可恢复 TFEB 活性。免疫荧光结果也显示，β-SIT 显著促进 FFA 处理肝细胞中 TFEB 入核。

为进一步明确 RAC1、mTOR 和 TFEB 之间的调控关系，研究检测了 RAC1 过表达和 mTOR 沉默对 TFEB 的影响。结果显示，RAC1 过表达导致核内 TFEB 蛋白表达下降，而 mTOR 沉默可逆转这一变化。RAC1 过表达抑制 TFEB 入核，而 mTOR 沉默显著增强 TFEB 核转位。

随后，为探究 β-SIT 在 RAC1-mTOR-TFEB 调控中的具体作用，研究在 AML-12 细胞中敲低 TFEB。Western blot 显示，TFEB 敲低显著降低 ATP6V1A、PGC1α 和 LAMP1 等溶酶体相关蛋白表达。并且，TFEB 敲低明显抑制 β-SIT 介导的自噬流增强，以及溶酶体与脂滴共定位促进作用。

综上，β-SIT 通过调控 RAC1-mTOR-TFEB 通路促进溶酶体生物发生和脂滴自噬，从而减少肝脏脂质蓄积。

图8 β-SIT 通过调节 RAC1-mTOR 通路促进 TFEB 核转位。
A：Western blot 检测核内 TFEB 蛋白水平，以及 ATP6V1A 和 PGC1α 蛋白水平；
B：采用多结构光照明显微镜评估 FFA 处理且有或无 β-SIT 干预的 AML-12 细胞中 TFEB 核定位；
C、D：RAC1 过表达和 mTOR 沉默处理后，检测核内 TFEB 蛋白水平及 TFEB 定位；
E：AML-12 细胞转染 siTFEB 或 siCon 后，经 FFA 和 β-SIT 处理 24 h，检测核内 TFEB 以及细胞内 LAMP1、PGC1α 和 ATP6V1A 蛋白水平；
F、G：AML-12 细胞转染 mCherry-GFP-LC3B 质粒评估自噬流，并展示代表性图像。黄色点表示自噬囊泡，红色点表示自噬溶酶体；黑色箭头表示溶酶体，红色箭头表示脂滴；
H：BODIPY493/503 标记脂滴，LysoTracker Red 标记溶酶体，采用多结构光照明显微镜获取荧光图像，并生成 3D 表面图。
比例尺：10 μm，局部放大图 1 或 5 μm。数据以均数 ± SEM 表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n.s. 表示无显著差异。

【Citation】:Wang Y, Sun Y, Wang CY, et al. β-Sitosterol ameliorates metabolic dysfunction-associated steatohepatitis by targeting the RAC1/mTOR/TFEB axis thus activating lipophagy-lysosomal pathway.Acta Pharmacol Sin.2026;47(4):946-963.

【贡献】★★★★★

本研究证明，β-SIT 可在体外 FFA 刺激的 AML-12 和 HepG2 细胞模型，以及体内 CDAHFD 或 HFD 诱导的小鼠模型中，通过靶向 RAC1 抑制下游 mTOR 通路激活，并促进 TFEB 核转位，从而恢复脂滴自噬功能。

进一步地，β-SIT 可通过解离溶酶体上的 RAC1-mTOR 复合物，促进溶酶体生物发生和自噬溶酶体形成，进而减轻肝脏脂质蓄积。

这些发现表明，β-SIT 可通过调控 RAC1-mTOR-TFEB 轴 发挥改善 MASH 的作用，为 MASH 治疗提供了一种新的潜在策略。

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