Chin Med I 丹酚酸B靶向Smad7去泛素化重塑TGF-β/Smad信号轴，强效逆转糖尿病性心肌病心肌纤维化 (沈祥春-贵州医科大学)

2023年12月，贵州医科大学基础医学院/药学院沈祥春团队联合实验动物中心，在Chinese Medicine （中科院2区，IF=5.7）在线发表题为 “Salvianolic acid B ameliorates myocardial fibrosis in diabetic cardiomyopathy by deubiquitinating Smad7” 的研究论文。该研究聚焦糖尿病性心肌病中心肌纤维化这一关键病理环节，围绕丹参主要水溶性活性成分丹酚酸B（Sal B）的心肌保护作用及分子机制展开系统研究。

研究团队通过高脂高糖饮食联合低剂量链脲佐菌素构建2型糖尿病性心肌病小鼠模型，并结合高糖诱导的心脏成纤维细胞模型，从体内和体外两个层面验证 Sal B 的抗纤维化效应。结果显示，Sal B 能显著改善 DCM 小鼠心功能，降低心脏肥大和左心室扩张程度，减少心肌炎症细胞浸润、胶原沉积及 α-SMA 表达，从而缓解心肌纤维化进展。

机制上，该研究进一步发现，Sal B 并非主要通过促进 Smad7 mRNA 转录来提高其表达，而是通过抑制 Smad7 泛素化降解，稳定 Smad7 蛋白水平，进而阻断 TGF-β1/Smad 信号通路的过度激活。细胞实验同样表明，Sal B 可抑制高糖诱导的心脏成纤维细胞增殖、迁移、表型转化及胶原分泌，提示其具有直接干预纤维化核心效应细胞的潜力。

该研究首次从 “Smad7去泛素化—TGF-β1/Smad信号轴—心肌纤维化” 角度阐明 Sal B 改善糖尿病性心肌病的潜在机制，为丹参活性成分防治糖尿病相关心血管并发症提供了新的实验依据，也为中药单体靶向干预心肌纤维化提供了重要思路。

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【摘要】

背景
丹酚酸B（Salvianolic acid B，Sal B）是来源于丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的一种水溶性酚类化合物，在中医中常用于治疗心血管疾病。我们此前的研究表明，Sal B 可保护机体免受糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）诱导的心肌纤维化损伤。本研究旨在探讨 Sal B 改善 DCM 诱导的心肌纤维化的作用及其潜在机制。

方法
本研究采用多种体内和体外实验方法，研究 Sal B 对 DCM 诱导的心肌纤维化的影响。这些方法包括血糖测定、超声心动图、HE 染色、Masson 三色染色、天狼星红染色、细胞增殖检测、羟脯氨酸水平测定、免疫组织化学染色、纤维化相关蛋白表达检测，包括 Collagen-I、Collagen-III、TGF-β1、p-Smad3、Smad3、Smad7 和 α-平滑肌肌动蛋白，以及 Smad7 基因表达分析和 Smad7 泛素化修饰分析。

结果
动物实验结果表明，Sal B 可显著改善心功能，抑制胶原沉积和表型转化，并通过上调 Smad7 抑制 TGF-β1 信号通路，从而改善 DCM 中的心肌纤维化。此外，细胞实验显示，Sal B 可显著抑制高糖（HG）诱导的心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）的增殖、迁移、表型转化和胶原分泌。Sal B 显著降低 Smad7 的泛素化水平并稳定 Smad7 蛋白表达，从而提高 CFs 中 Smad7 蛋白表达，并抑制 TGF-β1 信号通路。这可能是 Sal B 缓解 DCM 诱导心肌纤维化的潜在机制。

结论
本研究揭示，Sal B 可通过去泛素化 Smad7、稳定 Smad7 蛋白表达并阻断 TGF-β1 信号通路，从而改善 DCM 中的心肌纤维化。

关键词
丹酚酸B；糖尿病性心肌病；心肌纤维化；TGF-β1 信号通路；Smad7 去泛素化。

01

研究背景及科学问题

自 20 世纪 50 年代以来，糖尿病（diabetes mellitus，DM）的发病率在全球范围内急剧上升，并已成为重要的公共卫生问题。2021 年，中国糖尿病患者人数达到 1.409 亿，这意味着每五人中就有一人患有糖尿病。糖尿病性心肌病（DCM）由糖尿病引起，是全球发病和死亡的重要原因之一，并导致超过 50% 的糖尿病相关死亡。

心肌纤维化是 DCM 的主要病理改变。心肌纤维化的病理特征包括细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积，导致心室壁增厚和僵硬，进一步引发心力衰竭、心功能障碍、心律失常和心肌梗死，最终导致心血管死亡。心脏成纤维细胞（CFs）由于参与 ECM 的更新，是心脏纤维化瘢痕形成的主要效应细胞之一。当发生心肌纤维化时，CFs 的增殖、迁移、表型转化和胶原分泌均显著增强。

CFs 向肌成纤维细胞分化是心肌纤维化中的关键过程，其中 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）被认为是肌成纤维细胞分化的标志物。肌成纤维细胞在纤维化过程中胶原沉积中发挥重要作用。因此，抑制 CFs 的增殖、迁移、表型转化和胶原分泌，是减轻心肌纤维化的重要策略。

此外，TGF-β1 信号通路是 DCM 纤维化发生机制中最重要的靶点。抑制 TGF-β1 信号通路可显著改善 DCM 中的心肌纤维化。Smad7 是 TGF-β1 信号通路中的关键负反馈调节因子。Smad7 可通过抑制受体调节型 Smads，如 Smad3 的磷酸化，阻断 TGF-β1 信号通路。大量证据表明，当 Smad7 表达下调时，心肌纤维化会显著加重。

然而，目前尚无针对 DCM 诱导心肌纤维化的有效治疗方案。丹酚酸B（Sal B）是丹参中的一种酚类化合物，丹参在中医中常用于治疗心血管疾病。Sal B 由三个丹参素分子和一个咖啡酸分子组成。由于其结构中含有多个酚羟基，Sal B 具有抗氧化特性。我们此前研究表明，Sal B 对 DCM 诱导的心肌纤维化具有潜在保护作用。

本研究通过体内和体外实验，探讨 Sal B 对 DCM 心肌纤维化的改善作用及其潜在机制，为 Sal B 改善 DCM 诱导的心肌纤维化提供证据，并促进中医药在临床中的应用。

02

重要发现及亮点

1. Sal B 改善 DCM 小鼠心功能

采用高脂高糖饮食联合低剂量链脲佐菌素（STZ）建立 2 型糖尿病模型。与对照组相比，高脂高糖饮食小鼠表现出明显的葡萄糖耐量受损和胰岛素抵抗。STZ 诱导后，小鼠血糖显著升高，当血糖浓度超过 11.1 mmol/L 时，确认 2 型糖尿病模型建立成功。

与对照组相比，造模 8 周后 DCM 小鼠的射血分数（EF）降低，提示 DCM 小鼠模型成功建立。DCM 小鼠心脏出现左心室肥厚和左心室扩张，心脏脏器指数显著升高。然而，Sal B 和二甲双胍（Met）治疗后，心脏肥大和左心室扩张明显改善，Sal B 和 Met 治疗组小鼠的心脏脏器指数显著低于 DCM 组。

心脏超声结果显示，DCM 小鼠心脏的左心室收缩末期容积（LVESV）和左心室舒张末期容积（LVEDV）显著增加，而 EF 和短轴缩短率（FS）显著下降。Sal B 和 Met 治疗后，上述指标均得到改善。综上，Sal B 可显著改善 DCM 小鼠的心功能。

图1 图注翻译：Sal B 对 DCM 小鼠心功能障碍的影响。
A：腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）；
B：血糖曲线下面积（AUC）；
C：高脂高糖饮食喂养 3 个月后观察到胰岛素抵抗（HOMA-IR）；
D：2 型糖尿病模型血糖水平；
E：DCM 小鼠心脏解剖图；
F：DCM 小鼠心脏脏器指数；
G：二维和 M 型超声心动图代表性图像；
H–K：小鼠心脏 LVESV、LVEDV、EF、FS 的定量结果。
N=8。数据以均数 ± 标准差表示。多组比较采用单因素方差分析，并进行 Tukey 检验。<0.05，#<0.01 vs. 对照组；*p<0.05，**p<0.01 vs. DCM 组。

2. Sal B 抑制 DCM 小鼠炎症细胞浸润、胶原沉积、表型转化及 TGF-β1 信号通路

组织学检查显示，DCM 小鼠存在明显的心肌肥大和炎症细胞浸润；而 Sal B 和 Met 治疗后，心肌肥大和炎症细胞浸润明显改善。

心肌纤维化的特征是纤维性细胞外基质蛋白，尤其是 I 型胶原（Col-I）和 III 型胶原（Col-III）的过度沉积。Masson 染色和天狼星红染色显示，DCM 小鼠心肌组织中存在大量胶原沉积，而 Sal B 和 Met 治疗可显著减少胶原沉积。

通过计算 Masson 三色染色后纤维化面积与总组织面积的比值，对心肌纤维化程度进行定量。结果显示，与 Sal B 和 Met 治疗组相比，DCM 组心肌组织中的纤维化面积比例显著升高。

Western blot 结果同样显示，DCM 小鼠心肌组织中 Col-I 和 Col-III 表达显著上调；Sal B 和 Met 治疗后，小鼠心肌组织中 Col-I 和 Col-III 表达显著下调，提示 Sal B 可显著减少胶原分泌。

肌成纤维细胞在纤维化过程中产生更多胶原，并负责胶原沉积。通过检测 α-SMA 表达评估成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。Western blot 结果显示，DCM 小鼠心肌组织中 α-SMA 表达显著上调；Sal B 和 Met 治疗后，α-SMA 表达显著下调，提示 Sal B 可显著降低 DCM 小鼠中的表型转化。

此外，Western blot 结果显示，DCM 小鼠心肌组织中 TGF-β1、p-Smad3 和 Smad3 表达显著上调，而 Smad7 表达显著下调。Sal B 和 Met 治疗后，TGF-β1、p-Smad3 和 Smad3 表达显著下调，Smad7 表达显著上调。这表明 Sal B 通过上调 Smad7 抑制 TGF-β1 信号通路，从而显著改善 DCM 小鼠心肌纤维化。

图2 图注翻译：Sal B 对 DCM 小鼠炎症细胞浸润和胶原沉积的影响。
A–C：心脏组织 HE 染色、Masson 染色和天狼星红染色；
D：Masson 三色染色胶原面积定量分析；
E：心肌纤维化相关蛋白表达水平；
F、G：蛋白表达定量结果。
所有蛋白表达均以 GAPDH 进行归一化。N=8。数据以均数 ± 标准差表示。多组比较采用单因素方差分析，并进行 Tukey 检验。<0.05，#<0.01 vs. 对照组；*p<0.05，**p<0.01 vs. DCM 组。

3. 原代新生大鼠心脏成纤维细胞的鉴定与形态观察

显微镜下观察，新生大鼠心脏成纤维细胞呈梭形，并具有多个突起。通过免疫细胞化学检测 CFs 的特异性标志物波形蛋白（vimentin），可见其丝状结构。用 PBS 代替抗 vimentin 抗体处理的阴性对照细胞未显示红色荧光，仅显示蓝色细胞核染色。相反，使用抗 vimentin 抗体染色的原代细胞表现出强烈红色荧光，并伴有蓝色核染色，证实 vimentin 的存在。定量分析显示，95% 的细胞 vimentin 呈阳性。

图3 图注翻译：原代新生大鼠心脏成纤维细胞的鉴定与形态。
A：培养 3 天后的 CFs 生长情况；
B：阴性对照；
C：vimentin 阳性细胞。

4. Sal B 抑制高糖诱导的 CFs 增殖

与对照组相比，40 mM 和 45 mM 葡萄糖显著增强 CFs 增殖。既往研究提示，40 mM 葡萄糖是诱导 CFs 增殖的最佳浓度。细胞增殖检测和 HE 染色结果表明，Sal B 在 12.5–50 μM 浓度范围内可显著抑制高糖诱导的 CFs 增殖。

图4 图注翻译：Sal B 对高糖诱导 CFs 增殖的影响。
A：高糖诱导心脏成纤维细胞增殖的剂量效应关系；
B：使用 xCELLigence 实时细胞分析仪检测 Sal B 对高糖诱导 CFs 细胞指数的影响，检测时间为 0–120 h；
C：Sal B 对高糖诱导 CFs 细胞指数的影响，检测时间为 24 h；
D：HE 染色。
细胞实验重复 3 次。数据以均数 ± 标准差表示。多组比较采用单因素方差分析，并进行 Tukey 检验。<0.05，#<0.01 vs. 对照组；*p<0.05，**p<0.01 vs. DCM 组。

5. Sal B 降低 CFs 的迁移和羟脯氨酸分泌

采用细胞划痕实验检测 Sal B 对高糖诱导 CFs 迁移的影响。与对照组相比，高糖显著增强 CFs 的迁移能力，而 Sal B 可显著抑制高糖诱导的 CFs 迁移能力。

通过测定心肌羟脯氨酸浓度评估心肌胶原含量。与对照组相比，高糖显著增加 CFs 的羟脯氨酸分泌；Sal B 则显著抑制高糖诱导的 CFs 羟脯氨酸分泌。

图5 图注翻译：Sal B 对高糖诱导 CFs 迁移和羟脯氨酸分泌的影响。
A：Sal B 对高糖诱导的新生大鼠 CFs 迁移的影响，检测时间为 24 h；
B：迁移结果定量分析；
C：Sal B 对高糖诱导 CFs 羟脯氨酸分泌的影响。
细胞实验重复 3 次。数据以均数 ± 标准差表示。多组比较采用单因素方差分析，并进行 Tukey 检验。<0.05，#<0.01 vs. 对照组；*p<0.05，**p<0.01 vs. DCM 组。

6. Sal B 抑制高糖诱导 CFs 中心肌纤维化及 TGF-β1 信号通路相关蛋白，并增加 Smad7 表达

与对照组相比，高糖诱导的 CFs 中 Col-I、Col-III、TGF-β1、p-Smad3、Smad3 和 α-SMA 蛋白水平均显著升高；Sal B 可显著降低这些蛋白水平。

结果表明，Sal B 可显著增加高糖诱导 CFs 中 Smad7 的表达，并抑制 TGF-β1 信号通路。Sal B 显著提高 Smad7 表达，这与免疫荧光染色结果一致。

图6 图注翻译：Sal B 对高糖诱导 CFs 中心肌纤维化相关蛋白表达的影响。
A：心肌纤维化及 TGF-β1 信号通路相关蛋白表达水平；
B：心肌纤维化相关蛋白表达的定量分析。所有蛋白表达均以 GAPDH 进行归一化；
C：TGF-β1 信号通路相关蛋白的定量分析。所有蛋白表达均以 GAPDH 进行归一化；
D：Sal B 对高糖诱导 CFs 中 Smad7 表达的影响；
E：Smad7 表达定量分析。
细胞实验重复 3 次。数据以均数 ± 标准差表示。多组比较采用单因素方差分析，并进行 Tukey 检验。<0.05，#<0.01 vs. 对照组；*p<0.05，**p<0.01 vs. DCM 组。

7. Sal B 通过去泛素化 Smad7 并稳定 Smad7 蛋白表达改善心肌纤维化

研究者假设 Sal B 可能通过基因转录增加 Smad7 表达，因此采用 qRT-PCR 探讨 Sal B 对高糖诱导 CFs 中 Smad7 mRNA 表达的影响。与对照组相比，高糖组 Smad7 mRNA 表达水平略有降低，但差异无统计学意义。Sal B 处理后，Smad7 mRNA 水平略有升高，但差异同样无统计学意义。结果表明，Sal B 并未增加 Smad7 的 mRNA 表达。

因此，研究者推测 Sal B 可能抑制 Smad7 的降解。为确定 Sal B 对 Smad7 蛋白稳定性的影响，使用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）抑制新蛋白合成。在 CHX 处理后 1、2、4、8 和 12 h 检测 Smad7 蛋白表达。HG 组 Smad7 表达逐渐降低；Sal B 组 Smad7 表达在 1 h 时最高，并维持在较高水平。在 2、4、8 和 12 h 时，Smad7 表达存在显著差异，说明 Sal B 可显著稳定 CFs 中 Smad7 的表达。

既往研究表明，心肌纤维化可促进 Smad7 泛素化并降低其稳定性，从而导致 Smad7 表达下降。本研究进一步验证 Sal B 是否可通过阻止 Smad7 泛素化改善 DCM 中的心肌纤维化。免疫沉淀实验显示，与对照组相比，Sal B 显著降低 Smad7 泛素化水平。这些结果证实，Sal B 可通过抑制 Smad7 泛素化发挥抗纤维化作用。

图7 图注翻译：Sal B 对 Smad7 表达的作用机制。
A：Smad7 和 GAPDH 的扩增曲线；
B：Smad7 和 GAPDH 的熔解曲线；
C：Sal B 诱导 Smad7 mRNA 表达的定量分析。Smad7 mRNA 表达水平以 GAPDH 归一化，采用 2^-△△Ct 方法计算；
D：高糖诱导不同时间点 Smad7 表达水平；
E：Sal B 诱导不同时间点 Smad7 表达水平；
F：Smad7 蛋白表达定量结果。Smad7 蛋白水平以 GAPDH 归一化；
G：Sal B 对 Smad7 泛素化的影响。
细胞实验重复 3 次。数据以均数 ± 标准差表示。多组比较采用单因素方差分析，并进行 Tukey 检验。<0.05，#<0.01 vs. 对照组；*p<0.05，**p<0.01 vs. DCM 组。

图8 图注翻译：Sal B 改善 DCM 中心肌纤维化的机制。
图8 示意 Sal B 通过影响 Smad7 泛素化、稳定 Smad7 蛋白表达，并抑制 TGF-β1/Smad 信号通路活化，从而减轻高糖环境下的心肌纤维化过程。

【Citation】:Luo H, Fu L, Wang X, Yini Xu, Ling Tao, Shen X. Salvianolic acid B ameliorates myocardial fibrosis in diabetic cardiomyopathy by deubiquitinating Smad7.Chin Med.2023;18(1):161. Published 2023 Dec 10.

【贡献】★★★★★

总之，本研究证明，在 DCM 小鼠模型中，Sal B 可通过经典 TGF-β/Smad 通路抑制胶原形成和沉积，从而部分改善心肌纤维化。此外，连续 8 周 Sal B 治疗改善了糖尿病小鼠左心室的结构和功能。

因此，Sal B 是一种有前景的治疗 DCM 诱导心肌纤维化的潜在药物。然而，仍需要更多临床数据来证实 Sal B 治疗 DCM 患者的安全性和有效性，并需要进一步研究以阐明其潜在作用机制。

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