清华大学最新综述|四大策略实现蛋白质定点修饰

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（来源：抗体圈）

对肽和蛋白质进行特定位点的化学修饰，长期以来都是化学生物学领域追求的核心目标——这不仅因为引入功能性基团能够排除异质性修饰的干扰、深入揭示蛋白质结构与功能的内在关联，更因为抗体-药物偶联物、细胞成像等下游应用对位点选择性的要求日益严苛，推动该领域迎来了爆发式进展。

清华大学李艳梅课题组近期在《Chemical Science》发表综述，将纷繁复杂的定点修饰策略归纳为四大类别——利用化学环境差异、标签修饰法、邻近驱动化学修饰以及酶法策略，全景展示了这一工具箱如何以前所未有的精度重塑蛋白质的化学面貌。

洞察微观差异：利用化学环境实现内源位点精准区分

同一种官能团在不同的化学微环境中会表现出截然不同的反应特性，研究者正是利用这一天然的不均一性开发出无需外源标签的选择性修饰方法，其中最具代表性的是利用亲核性差异对氨基基团进行区分以及利用氧化还原性质差异对末端和侧链基团进行选择性官能化。

N-末端氨基因其亲核性通常高于赖氨酸侧链的ε-氨基而成为理想的靶点——Miller等人利用铜介导的芳基化反应实现温和条件下的N-末端选择性修饰，而Lin等人则开发了钯催化的可逆N-末端肉桂酰化策略，兼容全部二十种天然氨基酸，并且可以在1,3-二甲基巴比妥酸存在下通过钯催化的脱肉桂酰化反应高效恢复天然肽或蛋白质结构，实现了开关式的可逆调控，这一独特的可逆性被成功应用于精准调节曲妥珠单抗的结合亲和力以及从细胞裂解液中实现无痕富集N-末端游离的蛋白质。

N-末端甘氨酸因其独特的几何约束也成为修饰热点：Purushottam等人利用邻位取代苯甲醛实现了专一性修饰，Machida等人则通过铜催化的[3+2]环加成实现了N-末端甘氨酸的双官能化。在氧化还原性质差异方面，Bloom和Garreau等人利用光氧化还原催化实现了C-末端的脱羧烷基化，而MacMillan课题组则系统开发了甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸的位点选择性光催化修饰，即便在含有六个酪氨酸残基的蛋白质中也能实现单一酪氨酸的完全选择性标记。

引入人工标签：以可编程方式重塑蛋白质反应性

当蛋白质内在性质差异不足以支撑高精度修饰时，人工引入标签便成为主动而有效的策略。

脱氢丙氨酸因其α,β-不饱和双键可发生多种转化，Josephson等人利用可见光驱动的自由基反应在脱氢丙氨酸位点安装了超过50种不同的侧链。

遗传密码扩展技术使非天然氨基酸的插入变得便捷——Liu等人引入含光笼醌甲基化物的氨基酸，光照激活后可快速与胺试剂共轭；Wang等人设计的pTAF和mTAF同时含有叠氮和四嗪两种生物正交手柄，可在一锅反应中安装荧光团、药物等多种功能分子，甚至实现了蛋白质的三重共轭。

在肽段标签方面，Zhang等人发现的“π-clamp”四肽序列FCPF通过芳香侧链活化半胱氨酸巯基，可在含有多个内源性半胱氨酸的蛋白质中选择性修饰该位点，成功用于抗体-药物偶联物的合成；Ohata等人发现的焦谷氨酸-组氨酸二肽标签则具有极快的反应动力学和优异的生物正交性。

邻近驱动精准打击：利用分子间相互作用实现局部富集

当目标残基本身反应性不足时，借助邻近残基或基团作为导向手柄、提高试剂局部有效浓度，便成为极为有效的策略。

Rai课题组开发的连接体导向修饰平台通过将连接体定位于赖氨酸，先后实现了对组氨酸、赖氨酸和天冬氨酸的单一位点选择性标记，并成功应用于抗体-药物偶联物的合成。

超分子相互作用同样可以拉近反应基团——Li等人利用葫芦脲同时容纳色氨酸和甲基紫精，将半胱氨酸和脱氢丙氨酸彼此靠近，克服了Michael加成在蛋白质修饰中的区域选择性限制，成功应用于KRAS这一复杂体系。

在C(sp³)-H键功能化方面，Chen课题组开发了一系列邻近基团导向的钯催化环化反应构建肽大环化合物，而Weng等人则利用天冬酰胺未经修饰的侧链作为导向基团，避免了外源导向基团的安装和移除，实现了肽的后期C(sp³)-H芳基化。

借力生物识别：酶促策略赋予位点选择性全新维度

酶对特定氨基酸序列或结构基序的天然识别能力，使其成为实现可预测、高效位点特异性修饰的理想工具。研究者通过对分选酶A进行改造，获得了识别APXTG基序的变体cW11以及识别Aβ肽天然LMVGG基序的变体，实现了组蛋白和淀粉样肽的高精度功能化。

在标签引导策略中，Hofmann等人利用泛素结合酶Ube9识别最小四残基标签IKXE，实现了该标签内赖氨酸的位点特异性酰基化；Ploegh和Durek等人开发的[C247A]OaAEP1突变体通过识别C-末端NGL基序形成硫酯中间体，可被伯胺捕获产生C-末端连接产物，并被进一步扩展到可调控的肽环化领域。

在结构引导策略中，研究者理性改造了微生物转谷氨酰胺酶以选择性修饰抗体铰链区的天然谷氨酰胺Gln295；Tsou等人则基于铁蛋白构建了人工金属酶平台，通过引入Cu(II)结合的非经典氨基酸和底物识别肽，在胰岛素上实现了单一位点组氨酸修饰，即便在更具反应性的残基存在时仍保持高选择性。

总结

尽管定点修饰领域已经取得了令人瞩目的进展，但部分方法转化产率偏低、外源标签限制了在天然蛋白质中的应用、大多数修饰不可逆等挑战依然存在。展望未来，机器学习算法对蛋白质反应性的预测、新型亲电试剂的理性设计、定向进化与AI辅助酶改造、以及超分子与刺激响应化学的发展，有望实现无标签的天然蛋白质精准修饰和可逆的时空可控标记，推动这一领域走向更加灵活而精准的新阶段。