Nature | 同一非编码RNA竟致两种罕见病？饱和编辑绘出RNU4-2“双面”致病图谱

撰文|亦

RNU4-2 编码主要剪接体的U4 snRNA【1】，其新发变异近期被发现是导致ReNU综合征（一种全球预计影响数万人的常见神经发育障碍）的原因【2,3】。然而，在饱和基因组编辑（saturation genome editing，SGE）实验开展前，领域对该基因变异与临床影响的精确关系认知存在重大空白：已知致病变异高度聚集在18个核苷酸的关键区域内，但关键区域外是否存在致病变异尚不明确。高达75%的患者携带同一个单碱基插入突变（n.64_65insT），其高复发率的原因未知。此外，现有的计算机预测工具（如CADD）无法有效区分 RNU4-2 的致病与良性变异。由于 RNU4-2 与基因组中的假基因及同源基因（如 RNU4-1 ）序列高度同源，此前缺乏可靠的实验模型来评估变异功能。

近日，弗朗西斯·克里克研究所Gregory M. Findlay团队与牛津大学Nicola Whiffin团队合作，共同在Nature上发表了题为Saturation editing ofRNU4-2reveals distinct dominant and recessive disorders的文章。研究 研究通过开发针对高同源区域的SGE策略，解决了上述问题，不仅提供了全基因范围的变异效应图谱以指导精准诊断，还进一步揭示了该基因不同结构域变异导致显性与隐性两种截然不同疾病的分子机制。

为了系统评估 RNU4-2 基因上所有可能变异的生物学效应，研究团队建立了一套针对该基因的饱和基因组编辑体系 。由于 RNU4-2 与假基因序列高度相似，直接编辑和扩增目标区域存在技术挑战。研究者选择在近单倍体HAP1细胞中进行实验，通过CRISPR-Cas9在基因上游独特序列处引入DNA双链断裂，并导入一个包含539种预设变异的文库，涵盖转录本内所有可能的单碱基替换、关键区域的1个核苷酸插入缺失及部分多碱基插入。实验通过比较细胞在第4天和第14天的变异频率变化，计算出每个变异的功能评分，负分代表变异导致细胞生长受阻。为确保评分的可靠性，研究者在文库中纳入了12个位于关键区域外茎环结构的1个核苷酸插入作为阴性对照，其平均功能评分为-0.009。 以这些对照为基准，确定了151个显著有害的变异。这些有害变异并非均匀分布，而是高度聚集在基因的特定区域，初步绘制出 RNU4-2 的功能效应图谱 。

获得功能评分后，研究者验证其能否有效区分已知致病与良性变异 。他们 将变异分为三类：已在ReNU综合征患者中发现的、在UK Biobank或All of Us等大型人群数据库中观察到的，以及两者均未出现的 。结果显示，所有18个ReNU综合征相关变异均功能评分显著低于-0.302，而人群数据库中81.0%（286/353）的变异评分正常。功能评分对二者的区分能力极佳，受试者工作特征曲线下面积（AUC）高达0.93，远优于计算机预测工具CADD（AUC仅为0.65）。基于这些数据，研究者将原先18个核苷酸的关键致病区域精确定义为两个更小区段：包含n.61_62插入位点的n.62-70区（对应T-loop），以及n.75-78区（对应Stem III）。在这两个区域中，85.4%（76/89）的受测变异表现出功能缺失，包括全部ReNU致病变异；而基因其余区域仅17.4%的变异评分显著。研究进一步通过高斯混合模型将功能评分校准为临床证据等级，为此前意义不明的变异（如n.76del、n.92C>G）提供了明确的良性判读依据。

明确功能评分可定性区分致病变异后，研究进一步探究评分数值是否能量化反映疾病严重程度 。研究者 将关键区域内的有害变异按评分分为“强有害”（低于-0.90）和“中度有害”（介于-0.90至-0.302之间） ，并结合143名ReNU综合征患者的临床表型数据进行分析。表型主成分聚类显示，携带中度有害变异（如n.63T>C和n.65A>G）的患者聚集在一起，与携带强有害变异的患者明显分离。具体表型对比中，强有害组患者出现严重发育迟缓、严重智力障碍和言语能力极差的比例均显著更高。同时，基于患者RNA测序数据的剪接事件主成分分析也显示，强有害组与对照组的剪接模式差异更大，而中度有害组则介于中间。这表明 SGE功能评分不仅能定性判断致病性，其量化数值还可预测ReNU综合征的临床严重程度 。

在研究ReNU综合征关键区域的同时，研究者注意到该区域之外也存在75个功能评分显著有害的变异，且其中84.0%可在人群数据库中以极低频率被观察到。 由于SGE实验在单倍体细胞中进行，这些变异若在人群中以杂合状态存在时未见疾病关联，则可能以隐性方式致病 。研究团队在全球罕见病队列中筛选并确认了20名携带双等位基因功能缺失变异的神经发育障碍患者。这些变异全部位于ReNU关键区域之外，且精确映射到U4 snRNA与剪接体其他组分相互作用的四个结构域：与U6相互作用的Stem II中央区、蛋白质结合所需的“k-turn”结构、Sm蛋白结合区以及末端茎环。值得关注的是，其中5个变异位点在编码次要剪接体同源组分的RNU4ATAC基因上有完全对等的已知隐性致病变异。这一发现 揭示了 RNU4-2 的一种全新隐性遗传神经发育障碍，其临床特征（如白质异常和小脑萎缩）与显性ReNU综合征截然不同，体现了同一非编码RNA基因通过不同区域的变异可引发遗传模式与临床表型均迥异的两类疾病 。

综上所述，本研究对非编码RNA基因RNU4-2进行了饱和基因组编辑，系统绘制了整个基因上所有可能变异的细胞适应性功能图谱 。 研究在关键区域之外发现了四个与剪接体蛋白结合相关的功能必需区域，这些区域的变异会导致一种全新的、临床特征与ReNU综合征截然不同的隐性神经发育障碍 。这项工作不仅为 RNU4-2 变异的临床诊断提供了关键的量化证据，还揭示了该基因通过显性与隐性两种不同遗传模式导致不同疾病的遗传多效性机制。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10334-9

制版人： 十一

参考文献

1. Nguyen, T. H. D. et al. The architecture of the spliceosomal U4/U6.U5 tri-snRNP.Nature523, 47–52 (2015) .

2. Chen, Y. et al. De novo variants in the RNU4-2 snRNA cause a frequent neurodevelopmental syndrome.Nature632, 832–840 (2024) .

3. Greene, D. et al. Mutations in the U4 snRNA gene RNU4-2 cause one of the most prevalent monogenic neurodevelopmental disorders.Nat. Med.30, 2165–2169 (2024) .

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