Nature｜张楹/殷昊团队联合开发高效定点基因写入工具—QuadPE

基因作为遗传信息的基本载体，储存并传递着生命体构建所需的全部指令。一旦基因特定区域发生突变或功能缺陷，便可能引发多种遗传病。超过95%的遗传病尚无根治手段，大多数患者仍长期面临严重的健康风险与沉重的家庭负担。传统基因治疗主要依赖病毒载体将功能正常的基因导入细胞，但该策略仍存在 诸多 局限，包括潜在的致癌风险 、非 整合载体难以维持长期疗效等问题。

CRISPR-Cas9技术显著推动了基因编辑 领域 的发展， 其 可高效诱导DNA双链断裂并依赖内源修复机制实现小规模序列改造。然而，遗传病致病突变类型复杂且高度异质，针对单一突变的编辑策略难以覆盖全部患者。因此， 需开发高效的定点 基因写入 技术，实现完整功能基因的精准插入，从而同时应对多种突变类型，提升 基因 治疗的普适性。

202 6年 4 月 22 日， 武汉大学 医学研究院 张楹 教授与 殷昊 教授课题组 联合 在 Nature 期刊发表题为 Quadruple pegRNA enables programmable and efficient large genomic insertion 的研究论文。 团队 开发 了一种 高效的定点基因写入技术QuadPE，该技术 以可编程的方式高效地 将千碱基级DNA（1.6至26 kb）插入基因组中。区别于整合酶介导的插入，QuadPE无需额外蛋白参与，通过一步法完成整合， 显著提升了插入长度、效率及精准度，为基因治疗提供突破性的工具。

定点基因写入是 实现致病突变 精准替换的理想策略， 也是基因编辑领域长期亟待突破的关键技术瓶颈。 然而， 现有DNA 定点整合 系统存在两大技术瓶颈： （1）插入片段长度和插入效率受限， 插入片段长度增加，效率显著下降 ；（2） 依赖 细胞周期 ，在 疾病治疗的慢速 分裂细胞 中效率低下。先导编辑技术（ Prime Editing, PE）能够在基因组 定点 高效生成3’ flap这一关键中间结构。 团队前期研究表明， 成对使用PE系统 可产生一对序列互补的3 ’ f lap, 其空间构型直接决定编辑结局 ：在PAM-out构型中，互补的3’ flap促进两个切口之间基因组序列的重复 ( Cell, 202 4 )；而在PAM-in构型中，则可实现目标序列的精准插入，同时删除两切口之间的原有基因组片段 ( Nature Methods , 2022) 。基于此，本研究提出：通过设计使 flap末端序列与外源供体DNA两端形成互补配对， 有望 引导外源DNA按照 预设 方向精准拼接 至 基因组，实现高效、可控的大尺寸DNA片段定点整合。 系统性筛选 24种组合后发现 ， 使用两对PE协同作用可获得最优插入效率，其中一对PE以 PAM-in或PAM-out 构型 靶向基因组产生两条3 ’flap（图1：flapA/B）作为引物，另一对PE靶向供体DNA生成互补的 3 ’flap（图1： f lap C/D ），从而引导供体DNA定点整合至目标位点（图1）。值得注意的是，基因组上 PAM-out设计 的 效率较PAM-in提高约1.5倍， 且 环形供体较线性供体具有更高 整合 效率 ， 这 暗示着P AM-out 设计 可能 在机制上 模拟外源 病毒 DNA或内源转座元件整合过程中，在插入位点两端形成短片段重复序列的特 征。

图1 QuadPE示意图

QuadPE利用先导编辑器分别在基因组和供体DNA模板上生产序列互补的2对引物（flap A/C, flapB/D ）。在引物配对的引导下，实现基因精准插入。

QuadPE系统在多个基因位点及多种细胞类型中展现出良好的普适性。在HEK293T和K562等细胞系中，可在多个内源位点实现1.6–9.5 kb外源片段的高效插入，最高效率可达40%。在Huh-7、Jurkat、Hepa1-6及小鼠胚胎干细胞中均 可 实现稳定高效的整合。 进一步 ，QuadPE可 介导 长达15 kb 乃至 26 kb的大片段DNA 插入 ， 显示 其在不同细胞背景、靶点及插入长度条件下均保持较高且稳定的编辑活性。与现有 基因写入 技术相比，QuadPE在 不同 插入 长度范围内 均 展现 显著优势， 当插入片段为9 .5 kb时， 其效率较整合酶体系eePASSIGE提高约11倍、较eePASTE提高约61倍，并 比 转座酶系统evoCAST提高约12倍。同时，通过插入GFP报告基因， 观测到绿色荧光蛋白的表达，表明 QuadPE可实现外源序列的稳定表达， 具 有良好的应用前景。

为评估QuadPE对细胞周期的依赖性，本研究分别 使用帕博西尼 （ Palbociclib ） 和胸苷 （ thymidine ） 将K562细胞阻滞于G1期和G1/S期 ，结果显示在细胞周期阻滞条件下仍能实现高效基因写入 。 进一步，在 原代 非分裂 小鼠神经元 中 ，QuadPE 介导的 4.6kb 片段插入效率高达 12.5% ，在原代人T细胞多个基因位点中，最高编辑效率可达51%。上 述结果表明，QuadPE不仅在增殖细胞中 保持高活性 ，在非分裂细胞及多种原代细胞中 同样具有 稳定 而高效的编辑能力 ，具有广泛的应用潜力。

在精准性与安全性评估方面，本研究 通过overlap PCR、out-out PCR及Sanger测序确认目标片段的正确整合 ，并 对基因组 与 供体连接位点进行 深度测序 ，精准连接 比例 高达约96.7% 。 同时， 对QuadPE进行 全基因组范围内 脱靶整合进行分析 ， 未检测到明显脱靶插入事件，表明 QuadPE在实现高效 定点基因写入 的同时，具有 优异的 编辑精度和极低的脱靶风险。

综上，本研究开发的QuadPE系统突破了传统基因组插入技术在效率、长度及细胞周期依赖性方面的瓶颈，实现了无需外源整合酶参与的可编程大片段精准插入，并在多种细胞类型（包括非分裂细胞和原代细胞）中展现出高效的编辑性能且几乎无脱靶效应，对高度异质性的遗传病提供了一种更具普适性的治疗策略。

该论文 的 第一作者为武汉大学医学研究院 博士后史亚晶 、 研究生丁梓怡和吴莹 ， 武汉大学医学研究院张楹教授和 殷昊 教授 为 共同 通讯作者。

https://www.nature.com/articles/s41586-026-10395-w

制版人： 十一

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