大、小分子药物非临床研究的区别

所有药物，包括生物制品和小分子药物在上市前都需要完成不同专业领域的研究，包括化学、生产和控制（CMC）、非临床（药代动力学、药理学、毒理学）以及临床（健康人/患者药理学和医学）研究，证明其安全、有效且质量可控。其中，非临床试验是药物开发中不可或缺的一部分，其主要目标是确保药物候选物在用于人体研究时是安全的。由于治疗性蛋白药物的性质、种属特异性和免疫原性，生物制品的非临床研究内容通常与小分子项目有所不同。本文主要分享下支持小分子药物和生物制品上市所需的非临床研究之间的关键差异和相似之处。

欧盟和美国在药物审批流程上存在差异。然而，对于这两个地区，无论是美国的新药临床试验申请（IND）还是欧盟的临床试验授权（CTA）申请，都要求进行非临床试验，才能进入临床试验阶段。非临床研究在药物开发中起着关键作用。一般来说，非临床研究的目的是确保候选药物在用于人体研究时是安全的。非临床研究提供剂量（初始安全剂量以及后续人体剂量递增方案）和毒性数据，以支持首次人体研究，并识别潜在的毒性靶器官以及停药后的潜在可逆性。此外，它们还确定免疫原性和临床监测的安全性参数，并建立临床研究中难以评估的毒性终点，如遗传毒性、生殖毒性以及致癌性，这些内容将包含在产品标签中。虽然有些非临床研究可以在开始临床试验后进行，但大多数需要在首次人体试验之前完成，以尽量减少临床试验参与者的风险。

非临床评估通常包括多种研究：药理学、一般毒性、生殖毒性、遗传毒性、毒代动力学和非临床药代动力学等。药理学研究包括主要药效学、次要药效学和安全性药理学研究。主要药效学研究旨在调查受试物对预期治疗靶点的作用机制和/或效果，主要药效学活性通过体外和/或体内实验进行评估。体外研究旨在考察对目标靶点的药理学活性。相比于小分子，生物药还需要在体外研究中考察与不同种属的靶点亲和力、活性等，帮助体内毒理研究种属的选择。相比之下，体内实验则用于解释作用机制并在不同药效模型中评估药理学活性。

次要药效学研究的目的是调查候选药物与预期治疗靶点无关的作用机制和/或效果，即脱靶作用。小分子因特异性通常较差，需要重点开展次药药效学的评估。生物药对治疗靶点具有高特异性，通常不用开展。当然，对于高活性药物，比如ADC、CAR-T等，脱靶研究也是必要的。

核心安全性药理学研究包括对呼吸系统、中枢神经系统和心血管系统的影响评估，通常应在首次人体试验之前进行。必要时，如需开展补充性和后续的安全性药理学研究，可以在后期临床开发中进行。

药代动力学（PK）方面，对于小分子药物，可以使用放射性标记或未标记药物在多种种属中进行充分的体内和体外吸收、分布、代谢和排泄（ADME）表征。其中，代谢数据可以为小分子相关动物种属的选择提供依据。对于生物药物，不像小分子药物那样通过CYP 450系统代谢，因此只需要开展有限的ADME有研究，通常仅开展体内PK研究。

此外，非临床安全性评估还可以提示存在风险的人群。对于预期长期使用或有特殊担忧的药物，会进行致癌风险评估。许多其他非临床研究（例如免疫毒性、光毒性、幼年动物毒性或依赖性研究）则根据具体情况开展。

其它方面，小分子和生物药在免疫原性、遗传毒性、组织交叉反应试验等方面也有所区别。

个中细节差异，具体来看下。

新分子实体（NME）

临床前研究是药物开发过程中至关重要的环节，其主要目标是：1）明确NME的靶器官毒性；2）阐明不良反应与药物暴露量、剂量依赖性的关系；3）评估不良反应的可逆性。

这些研究数据用于：通过异速缩放法（allometric scaling）估算人体临床试验的安全起始剂量；确定临床试验中需重点监测的潜在不良反应指标。

临床前研究通常分为两大类：药理学研究、药代动力学研究、毒理学研究。通常先进行药理学研究，因其对不良反应的初步发现可指导后续毒理学试验的设计。

1.药理学研究

1.1主要药效学研究

化药大都作用于细胞内，故体外多会开展一些对关键激酶、蛋白、信号通路的影响研究，明确作用的强度和机制。细胞学活性也是常用评估手段。体内药效则与生物药在模型上比较相似，可能的区别体现在生物药多结合在细胞胞外区，很多靶点的种属间序列一致性，尤其靶蛋白结合区域可能存在种属区别，有些动物模型不如小分子用起来方便。

1.2次要药效学研究

相较于生物药，小分子化药的特异性并不好，超过一半的小分子药物至少结合5个不同靶点。真实数字可能更高，毕竟大部分药物只开展了有限的靶点结合验证，实际潜在靶点却超过数千个。多靶点结合带来的多药理作用并不完全是坏事，有可能使药物具有多个适应症，比如阿司匹林，结合23个不同靶点，调节多条信号通路，在抗炎、解热镇痛、心血管疾病中均发挥作用。也有药物因为脱靶结合而退市，比如抑制hERG或激活5-HT2b受体引发心脏安全性风险的药物。

次要药效学研究有一个基本的panel组合，是基于Bowes、Lynch等人早期研究建立的一个组合，包括44个靶点。除了以上靶点外，根据对18家国际药企调研结果，还有额外33个新的靶点也建议添加到次要药理学研究的组合中。具体靶点清单、脱靶累及的组织或器官以及靶点激活或抑制潜在引发的毒性总结在下表之中。

1.3安全药理学研究

本部分旨在评估药物对关键生命功能系统的潜在不良影响。根据ICH S7A指南，核心组合（core battery）必须包括以下三大系统：

需要注意的是，核心组合可能无法覆盖所有潜在风险。若基于药物类别、前期研究或临床数据发现其他安全性担忧（如肾脏、泌尿、胃肠功能影响），应开展补充性安全药理学研究（supplemental studies）。

另外，安全药理学研究存在一些豁免情况。在以下情形中，首次人体给药前可能无需进行完整安全药理学研究：1）局部用药（如外用、滴眼剂）：若已证明其全身暴露极低且药理作用明确；2）用于终末期癌症患者的细胞毒药物，但若其作用机制新颖，仍建议开展相关研究以识别非预期毒性。

安全药理学评估应在首次人体试验（FIH）之前。若重复给药毒性试验（如28天或90天研究）已充分涵盖核心系统的功能终点（如持续监测心电、行为、呼吸等），则可减少或免除单独的安全药理学试验。不过，从一些成熟案例来看，大部分小分子化药选择单独开展安全药理学研究。如下表所示，37款化药中，25款选择了单独开展的形式。

2.药代动力学（PK）与毒代动力学（TK）研究

PK研究旨在获取候选药物的全身暴露程度与持续时间信息，是临床前开发核心药理学组成部分，通常采用放射性标记与非标记药物，在多种动物中开展体内、体外实验。TK则是在临床前毒性研究中整合获取PK数据（或通过专门设计的支持性研究），用于评估药物全身暴露水平，为毒性结果解读及临床安全性关联分析提供依据，其数据通常嵌入毒性研究中同步收集。

临床前PK与代谢研究的多个组成部分均有助于毒性结果的解读，但TK数据更聚焦于毒性研究特定条件下候选药物的动力学特征。PK研究的核心目标是阐明药物的吸收、分布、代谢与排泄（ADME）过程。

2.1 ADME各环节研究要点

吸收（Absorption）

临床前吸收特性研究通常通过给药后连续测定血液和尿液中的药物浓度，评估吸收程度与速率。需同时开展静脉给药研究作为参比标准，核心评价的PK参数包括：血浆药物浓度-时间曲线下面积（AUC）、最大血浆浓度（Cmax）及给药后特定时间点的血浆浓度（Ctime）。生物利用度指药物到达全身循环的量，其高低取决于药物的吸收程度及进入全身循环前的代谢水平。

分布（Distribution）

分布研究旨在明确药物及/或其代谢产物在组织中的蓄积与消除程度及时间进程，通常通过给药后特定时间点处死实验动物，测定目标组织中的药物/代谢产物浓度实现。常规开展单次给药分布研究，在以下场景需考虑重复给药分布研究：1）单次给药组织分布研究显示，药物（及/或代谢产物）在器官/组织中的表观半衰期显著长于血浆消除相表观半衰期，且超过毒性研究给药间隔的2倍；2）重复给药PK/TK研究中测得的循环系统药物/代谢产物稳态水平，显著高于单次给药动力学研究的预测值；3）观察到短期毒性研究、单次给药组织分布研究及药理学研究无法预测的、对药物安全性评价至关重要的组织病理学改变（此类研究需聚焦病变靶器官）；4）药物针对特定部位靶向递送开发时。

分布评估的关键参数还包括分布容积，其反映体内药物总量与血液/血浆药物浓度的相关性：若药物广泛结合血浆蛋白但与组织成分结合有限，分布容积将接近血浆容积。

代谢（Metabolism）

为全面理解药物的安全性与有效性，需在毒性研究所用动物种属中评估并量化药物的代谢谱。需注意种属间毒性差异可能与药物代谢差异相关，代谢谱分析需通过给药后不同时间点测定血浆、粪便、胆汁、尿液及其他组织中药物及其主要代谢产物的浓度实现。

药物进入体内后通过Ⅰ相和Ⅱ相代谢途径进行生物转化：1）Ⅰ相反应生成的代谢产物更易具有化学活性或药理活性，需重点开展安全性评价（如活性代谢产物可能结合治疗靶点或其他受体、与酶/蛋白相互作用引发非预期效应）；2）Ⅱ相结合反应通常使化合物水溶性增强、药理活性丧失，一般无需进一步评价，但如生成酰基葡萄糖醛酸等毒性结合物，需补充安全性评估。

需特别关注种属间代谢差异：1）仅在人类中生成的代谢产物罕见，但人类中代谢产物水平显著高于临床前安全测试动物种属的情况较常见；2）若至少一种实验动物种属在母体药物毒性测试中，代谢产物暴露水平达到或超过人类暴露水平，可认为该代谢产物对整体毒性评估的贡献已得到验证；3）化学活性中间体代谢产物因半衰期短难以直接检测，但可通过其稳定产物（如谷胱甘肽结合物）间接测定；4）对靶点受体无药理活性的代谢产物，不能默认无毒性，需通过临床前毒性研究验证。

代谢产物的临床前表征原则：仅当人类中代谢产物暴露量占药物相关总暴露量的10%以上，且显著高于毒性研究中的最大暴露水平时，需开展临床前表征（通常支持Ⅲ期临床试验）。每日给药剂量＜10mg的药物，可适当提高代谢产物测试的暴露量阈值。多数谷胱甘肽结合物等代谢产物无需毒性关注，而具有明确风险的代谢产物（如人类特有代谢产物）需个案评估。该10%阈值标准与FDA及美国环境保护局（EPA）指导原则一致。

代谢产物毒性评估方法：优先筛选常规毒性研究种属中能生成目标代谢产物且暴露水平相当或高于人类的种属，开展针对性毒性研究。若无法找到合适种属，需合成该代谢产物并直接给药动物进行安全性评价（需开发能在临床前毒性研究中识别和定量该代谢产物的分析方法）。不过，直接给药代谢产物可能存在局限性（如后续代谢与临床场景不一致、引发母体药物未出现的新毒性），但为保障临床安全，代谢产物的识别与潜在毒性评估至关重要，是否开展直接安全性测试需基于母体药物数据及代谢产物现有信息综合判断。

排泄（Elimination）

药物排泄或清除率反映实验动物给药后排出药物的能力，排泄速率与药物浓度相关，清除率（CL）定义为排泄速率与浓度的比值（CL=排泄速率/C）。通常药物排泄迅速且完全时，毒性风险更低。

2.2 TK的核心作用与应用原则

TK是临床前测试计划的重要组成部分，其价值体现在：助力毒性试验结果解读、作为人类风险与安全性评估的核心环节衔接临床前与临床数据。由于TK整合于毒性测试中，核心聚焦毒性结果解读而非表征药物基础PK参数。

无需在所有研究中均收集TK数据，需基于科学判断确定数据的实用性。

2.3临床前PK/TK数据的提交时机要求（依据ICH S3A）

启动人体临床试验前，需评估动物与人类的体外代谢数据、血浆蛋白结合数据，以及重复给药毒性研究所用种属的全身暴露数据；

大规模人群暴露或长期治疗前（通常在Ⅲ期临床试验前），需补充以下数据：测试种属的PK详细信息（吸收、分布、代谢、排泄）、与潜在药物相互作用相关的体外信息，用于比较人类与动物代谢产物差异及判断是否需要补充测试。

3.毒理学

体内动物毒理学研究和体外研究可用于评估药物在短期和长期使用中可能引起的功能性和形态学不良反应。具体开展哪些毒性试验，取决于药物的性质、预期用途以及计划在临床试验中的使用范围和时长。

典型的毒性测试项目包括以下几类：

3.1急性毒性研究（单次给药毒性研究）

目的：评估药物在单次给药或24小时内多次给药后产生的短期不良反应。

实验设计：在两种哺乳动物（其中一种为非啮齿类）中进行。通常采用临床拟用给药途径，必要时也可包括注射途径。也可通过剂量递增研究或短期剂量范围研究确定最大耐受剂量（MTD），替代传统单次高剂量致死实验。本研究不应以动物死亡作为研究终点。

提供信息：人类急性中毒的可能性；估算人体安全的单次剂量；潜在毒性靶器官；药物引起临床症状的时间进程；为重复给药毒性研究提供剂量依据；不同物种间毒性反应的差异。

临床意义：应在III期临床前获得急性毒性数据；对于易发生过量用药的患者群体（如抑郁症、疼痛、痴呆等门诊患者），应更早评估急性毒性风险。

3.2重复给药毒性研究

包括亚急性、亚慢性和慢性毒性研究，在两种动物（一种非啮齿类）中进行，用于评估药物长期使用的潜在毒性。

一些基本原则或情况：动物研究的持续时间应等于或超过对应阶段人体临床试验的用药时长；通常每日给药；明确毒性靶器官；评估毒性是否可逆。

设置最高剂量和最低无可见有害作用水平（NOAEL）。NOAEL应显著高于预计的人体最大临床剂量。

亚急性和亚慢性研究结果常用于确定致癌性试验的剂量（如MTD）。

MTD定义：能引起轻微毒性但不显著缩短动物寿命（非因肿瘤）的最高剂量。

(1)亚急性毒性研究

持续时间通常2–4周，为后续亚慢性/慢性研究选择剂量，支持用药不超过4周的早期临床试验。局限性在于不足以发现长期用药可能出现的继发效应。

(2)亚慢性毒性研究

持续时间通常1–3个月（通常为90天），用于支持最长3个月的临床试验。

(3)慢性毒性研究

持续时间通常为6个月至1年，用于确定长期毒性靶器官，评估毒性可逆性，确定NOAEL，评估长期用药下的临床风险。

根据ICH S4A），啮齿类最长6个月，非啮齿类9个月。

FDA存在灵活处理的场景，可接受6个月非啮齿类研究的情况：1）用于短期间歇治疗的慢性病（如细菌感染、偏头痛、勃起功能障碍、疱疹）；2）用于危及生命的疾病（如晚期癌症化疗或辅助治疗），且已有充分长期人体数据。

需进行12个月研究的情况：药物基于短期临床试验（使用替代终点指标）获批，但缺乏长期人体安全性数据（如某些艾滋病疗法）；属于全新药理类别，无同类药物长期毒性经验。

开展时机：应在II期临床显示有效性后启动，可与III期临床同步进行，用于支持长期临床试验的安全性评估和上市批准。

3.3遗传毒性研究

目的：检测化合物是否通过直接或间接机制引起DNA损伤，包括：基因突变、染色体结构损伤（如断裂、重排）、染色体数目异常、重组事件。

这些损伤若被“固定”（即未被修复并传代），可能引发可遗传效应或参与多步骤致癌过程。

研究要求：无单一试验能检出所有遗传毒性物质，因此需采用组合试验策略（in vitro+in vivo）。

根据ICH S2(R1)，推荐的标准试验组合包括：细菌基因突变试验（Ames试验）；哺乳动物细胞体外染色体损伤试验（如体外微核试验）或小鼠淋巴瘤tk基因突变试验；体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验（如骨髓微核试验）。

结果解读与后续行动：1）阴性结果：完成标准组合通常足以证明无遗传毒性风险；2）阳性结果：需根据药物适应症决定是否进行扩展试验。

临床开发阶段要求：1）单次给药临床试验（如I期）：仅需基因突变试验（如Ames）即可支持；2）重复给药临床试验：必须额外完成哺乳动物系统染色体损伤评估。完整遗传毒性试验组合应在II期临床前完成。

3.4致癌性研究

是否需要开展？非注册必需前置条件，有些情况下可在上市后承诺完成，甚至某些情况下无需进行。

通常使用大鼠和小鼠，持续2年，给药途径应与临床一致。

需要开展的情况：药物预计连续使用≥6个月；或用于慢性/复发性疾病，虽为间歇用药但频繁长期使用（如哮喘、银屑病）。

无需开展的情况：短期或极少使用的药物（如麻醉剂、放射性显像剂），除非有特殊担忧。

触发致癌性研究的其他因素：1）同类药物已有人类相关致癌证据；2）构效关系（SAR）提示致癌风险；3）重复给药毒性试验中发现癌前病变；4）药物或代谢物长期滞留组织，引发局部病理反应；

明确遗传毒性阳性：此类化合物通常被视为跨物种致癌物，无需再做长期致癌试验。但若拟用于长期人体治疗，仍建议进行最长1年的慢性毒性研究，以早期发现肿瘤信号。

上市时间安排：一般应在提交上市申请前完成致癌性研究；但对于严重或危及生命疾病（如晚期癌症、无有效疗法的罕见病），可推迟至上市后进行；若目标人群预期寿命<2–3年，可豁免长期致癌试验。

3.5生殖毒性研究

研究外源物质对生殖功能、胚胎发育及子代健康的不良影响。

法规要求（FDA&ICH）：凡用于育龄女性（WOCBP,Women of Childbearing Potential），无论是否针对孕妇，均需进行生殖毒性评估。

经典三段式试验设计（ICH S5）：1）生育力与一般生殖表现（Segment I）：大鼠，评估雄性和雌性生殖功能；2）致畸性/胚胎-胎仔毒性（Segment II）：大鼠和兔，评估器官形成期毒性；3）围产期与出生后发育（Segment III）：大鼠，覆盖妊娠晚期至哺乳期。

临床试验中的阶段性要求（依据ICHM3(R2)）：1）男性受试者：可在完成雄性生育力专项研究前纳入I/II期试验。因重复给药毒性研究（≥2周）已包含睾丸组织病理学检查，其敏感性等同于专门生育力试验；不过，在大型或长期临床试验（如III期）前，应完成雄性生育力专项研究。2）育龄女性（WOCBP）：核心原则是要防止无意中暴露胚胎/胎儿，需评估风险并采取避孕措施。两种风险控制方式，一是完成生殖毒性研究，明确内在风险，并在试验中采取防护。二是严格避孕，包括高效避孕方法、妊娠检测、确认月经来潮后入组。

那么何时必须完成生殖毒性研究呢？若WOCBP未使用高效避孕或妊娠状态不明，则必须在入组前完成：1）所有女性生殖毒性研究（三段）；2）完整遗传毒性试验组合。孕妇入组临床试验前，同样需完成上述全部研究，并有人体安全性数据支持。

区域差异与灵活性：1）欧盟和日本：要求在WOCBP暴露前完成确定性发育毒性研究（Segment II）；2）美国：若采取严格避孕措施，可推迟至III期前完成胚胎-胎仔发育研究；3）所有ICH地区：WOCBP可参与重复给药的I/II期试验，前提是已完成重复给药毒性研究（含卵巢评估）；III期或大规模长期试验前，需完成女性生育力专项研究；上市批准前，必须完成围产期与出生后发育研究（Segment III）。

特殊情况下的早期入组：若已有两个物种的初步生殖毒性数据，且临床试验规模小（≤150名WOCBP）、疗程短（≤3个月）、采取严格避孕措施。则可在完成确定性生殖毒性研究前纳入WOCBP——基于此类试验中妊娠发生率极低，且初步研究已能识别主要发育毒性风险。

3.6特殊毒理学研究

免疫毒性研究

所有拟用于人体的新分子实体均应评估其潜在免疫毒性。

评估方式：首先通过常规毒理学研究（如重复给药毒性试验）观察是否有免疫相关信号（如淋巴器官重量变化、血液学异常等）；若存在可疑信号，需基于“证据权重法（weight-of-evidence）”决定是否开展额外的专门免疫毒性研究。

时间要求：若需开展额外研究，应在大规模人群暴露前完成（如III期临床试验前）。

光安全性研究

药物引起的光毒性皮肤反应或眼部光损伤日益受到监管机构和制药行业重视，已成为非临床开发的必要环节。

是否需要开展？取决于以下因素：1）NME的光化学性质（如吸收波长、光反应活性）；2）结构类似物是否具有光毒性；3）药物在皮肤和眼睛中的分布；4）非临床研究中是否出现疑似光毒性表现（如光照后皮肤/眼组织损伤）。

实施建议：初步评估应基于NME的光化学特性及药理/化学类别；若综合数据提示存在显著人体光毒性风险，应在临床试验中采取防护措施（如避光、防晒指导）；应进一步评估药物在皮肤和眼部的分布，以判断是否需要补充试验；必要时，在大规模临床试验前（如III期）开展体外、体内或临床光毒性试验；

若评估提示潜在光致癌风险，需在临床试验知情同意书中加入警示；上市后药品说明书中明确风险提示。

药物滥用潜力评估

对具有中枢神经系统（CNS）活性的药物（无论适应症），均应考虑是否需评估其滥用潜力。

目的：支持临床滥用潜力研究设计；协助监管机构进行药物分类/管制（如是否列入管制药品）；为药品说明书提供依据。

评估策略：1）早期筛选（临床前）：开展体外受体结合实验，明确药物及其活性代谢物在脑内的作用靶点（如受体、转运体、离子通道）；关注与滥用相关的神经递质系统：多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺、GABA、乙酰胆碱、阿片系统、NMDA、大麻素系统等；通常在首次人体给药前获得药代/药效（PK/PD）特征（如起效快、作用时间短易被滥用）；化学结构与已知滥用药物相似；受体结合谱提示成瘾通路激活；动物行为学表现（如兴奋行为）。若早期无滥用信号，可能无需深入评估，但若存在已知滥用信号或全新CNS作用机制，则需进一步研究。2）正式滥用潜力模型（通常在III期前完成）：推荐在啮齿类动物中进行（前提是其代谢和靶点与人相似）；若啮齿类模型不适用，可考虑非人灵长类。常用三种核心试验，一是药物辨别试验（Drug discrimination），评估药物是否产生类似已知滥用药物的主观效应。二是自我给药试验（Self-administration），直接反映动物是否“主动寻求”该药物。三是戒断反应评估（Withdrawal assessment），该研究可整合到重复给药毒性研究的“可逆性”部分。3）剂量选择：推荐使用远高于人体治疗剂量的血药浓度（通常为治疗浓度的数倍），以充分暴露潜在滥用效应。

监管沟通建议：建议在II期结束前与监管机构沟通，明确是否需要开展动物滥用研究及最佳时机；I期阶段通常不适宜开展正式滥用研究，因有效剂量尚未确定，可能导致剂量选择不当，影响结果可靠性。

局部耐受性研究

评估药物在给药部位（如注射、吸入、皮肤）是否引起刺激、炎症或其他局部不良反应。

实施原则：应使用拟用于临床的给药途径进行评估；不应作为独立研究，而应整合进常规毒理学试验中，以减少动物使用；对于注射剂，还需评估非预期注射部位（如静脉旁渗漏）的耐受性，尤其在III期前完成。

区域差异：1）美国通常不要求单独的静脉旁给药研究；2）欧盟和日本建议对静脉制剂进行单次静脉旁（paravenous）给药评估；3）若使用新型静脉辅料，需单独评估其局部耐受性。

生物制品

生物技术来源药物（也称生物制药或生物制品）是一类结构复杂、分子量大的治疗产品，例如：单克隆抗体（mAbs）、重组蛋白、核酸类药物（如基因治疗载体、siRNA等）。这类产品与传统小分子化学药在理化性质、作用机制和代谢特征上存在显著差异。

常规用于小分子药物的非临床安全性研究方案通常不适用于生物制品。每种生物制品的非临床研究“组合包”都需量身定制（individualized design）。

不过，生物制品的非临床安全性评价的目标与小分子药物是一致的，包括：识别潜在毒性；确定临床监测的关键指标；支持人体起始剂量和给药方案的确定。

生物制品毒理学研究的主要特点还包括：

1.给药方案更贴近临床

动物试验中的给药途径和给药频率通常直接模拟拟用于人体的治疗方案（如静脉输注、每周一次等）。

2.必须使用“药理相关种属”（Relevant Species）

指该动物体内表达与人相同的靶点（如受体、抗原表位或启动子序列），从而使药物能产生药理活性。比如单抗需表达相应抗原表位；重组蛋白需表达对应受体；基因治疗产品需具备可被调控的启动子序列。主要目的是确保观察到的毒性是由药理作用本身（on-target effect）引起，而非非特异性反应。

在人体试验启动前及整个临床开发过程中，对新型生物制品（New Biological Entity）进行药理学和毒理学特征的全面表征。

若某生物制品在结构和药理作用上与已有丰富临床经验的产品高度相似，可适当减少毒性试验的广度。

试验设计需考虑的关键因素：相关动物种属的选择（药理响应种属）；动物的年龄与生理状态；给药方式，包括剂量、给药途径、治疗方案；供试品在使用条件下的稳定性。

GLP（良好实验室规范）要求：毒性试验应尽可能符合GLP。但某些使用特殊检测系统的研究（如复杂生物测定）可能无法完全满足GLP，此时应明确说明不符合项，并评估其对整体安全性评价的影响。不完全符合GLP≠数据无效——在合理解释下，仍可用于支持临床试验和上市申请。

生物制品与小分子药物的非临床开发策略差异详见下表。

1.药理学研究

1.1药效学

通过体外结合实验（如靶点亲和力测定）和体内动物模型实验评估生物制品的药理活性。目的是阐明其作用机制及是否具备临床相关生物效应。

由于生物制品通常具有高度靶向特异性，一般不常规开展针对非治疗靶点的广谱筛选研究，即不评估脱靶效应，除非有特别担忧。

1.2安全药理学研究

小分子药物通常需进行核心安全药理学组合试验（评估对心血管、呼吸、中枢神经系统等的影响）。生物制品因高度靶向性，一般无需单独开展此类研究。

其安全药理学指标可整合到常规毒理学研究中一并考察（如在重复给药毒性试验中监测心电、呼吸功能等）。

之前笔者回顾性分析了已上市的144款单抗、多抗及ADC类药物，大部分生物药物安全药理学研究是以伴随一般毒理研究开展的形式为主，而且是心血管、呼吸系统、中枢神经系统的终点均纳入一般毒理试验中考察。如下表所示。

2.药代动力学与毒代动力学

本研究目的是建立系统暴露量（如AUC、Cmax）与药效/毒性之间的关系；PK参数（清除率CL、半衰期、分布容积Vd等）对解读毒性数据至关重要，应纳入常规毒理研究。

与小分子化药不同，生物制品不经过CYP450酶系统代谢，主要通过蛋白水解降解为小肽和氨基酸，随后被排泄或再利用。因此，无需进行小分子药物式的经典生物转化研究。

组织分布研究方面，可使用放射性标记的生物制品进行组织分布研究，帮助识别潜在风险器官。但需注意，放射性标记可能因快速代谢或标记键不稳定而难以准确追踪。氨基酸标记存在循环再利用问题——放射性可能掺入非药物相关蛋白，导致结果误判。解读此类数据需格外谨慎。

PK研究实施要点：应使用与毒理和临床试验一致的制剂；采用拟用于临床的给药途径；吸收模式受多种因素影响：剂型、浓度、注射部位、免疫原性、给药体积等；免疫介导的清除（如抗药抗体产生）可能显著改变PK曲线，进而影响毒性解读；毒理研究中应同步监测系统暴露水平；PK采样应覆盖至少3–5个半衰期，以充分描述药时曲线。

动物模型选择：PK研究通常在健康的相关动物种属中进行；鼓励使用疾病动物模型，因其更能反映真实临床的PD效应和PK特征；不推荐在非相关种属中进行PK研究，因缺乏靶点结合，药物清除机制（如靶点介导的内化）可能失效，数据临床相关性低。

在进入临床前，应获得相关动物模型中的吸收、分布和清除信息。用于基于暴露量（而非仅剂量），为首次人体试验提供安全窗口依据。

3.毒理学研究

在生物制品进入人体试验前，必须通过动物毒理学研究达成以下主要目的：1）识别毒性靶器官，并评估停药后毒性是否可逆；2）确定人体I期临床试验的安全起始剂量及后续剂量递增方案；3）明确临床试验中需监测的安全性参数；4）为药品说明书中的安全性信息提供数据支持。

动物种属选择“药理相关种属”。那么什么是“药理相关种属”？

1）表达与人相同的靶抗原/表位或同源受体；2）其组织交叉反应谱与人类高度相似；3）药物在其体内能产生预期的药理活性（即“on-target”作用）。

如何确定相关种属？1）免疫组化（IHC）：使用多物种组织芯片进行抗原分布筛查；2）流式细胞术（FACS）：检测药物与动物来源细胞的结合，通常比IHC更敏感；3）序列比对：比较靶抗原在不同物种间的DNA和氨基酸序列同源性；4）功能与结构一致性：靶点在动物与人之间的分布、功能、结构应尽可能一致，以确保观察到的毒性（尤其是on-target毒性）具有临床预测价值。若动物与人在靶抗原组织分布上差异较大，虽不完全排除使用，但需在人体风险评估中谨慎考量这些差异。

监管要求：在注册申报资料中，必须提供所选动物种属的相关性依据；若仅使用一个种属，还需说明为何未发现其他相关种属。

关于种属数量策略：至少在一个药理相关种属中开展毒理研究；若在两个种属中均显示药理活性（经28天试验确认），则两者都应纳入毒性评估；若28天毒性结果在两物种中相似，后续长期毒性研究可仅用一个种属；若仅在一个种属中有药理活性，且机制明确，则无需在第二物种中使用同源替代品进行测试。

无相关动物种属时的替代策略1）转基因动物模型：工程化表达人源靶抗原，成功与否取决于抗体-抗原相互作用所产生的药效学（PD）是否与人体预期一致；2）使用替代分子：开发一种能与动物同源抗原结合的替代分子，用于毒理研究。局限性在于替代分子≠拟用于人体的治疗分子，二者在生产工艺、杂质谱、PK特性、亲和力、作用机制等方面可能存在差异，且增加研发成本与不确定性。英夫利昔单抗、依法珠单抗的生殖/发育毒性研究曾成功采用此策略。

若上述两种方案均不可行，仍可考虑：评估脱靶毒性（off-target）对主要生理系统的影响；利用表达靶抗原的人源细胞进行体外研究，评估on-target效应及有效生物剂量。但此类体外数据对人类风险的预测能力有限，需结合更充分的药理学信息谨慎解读。

3.1单次给药毒性研究

虽然单次给药毒性研究可提供剂量与全身/局部毒性之间的关系信息，但目前企业普遍跳过此类研究。

单次给药毒性研究数据可用于支持重复给药毒性研究中的剂量选择。剂量-反应关系信息也可通过单次毒性研究、药理学研究或动物疾病模型疗效研究获得。建议在这些研究设计中纳入安全药理学参数。

3.2重复给药毒性研究

物种选择：通常推荐使用两个相关动物种属进行安全性评价；在特定情况下（如仅有一个相关种属，或对生物制品的生物学活性已充分了解），一个种属可能足够；若短期研究中两个种属毒性特征相似，长期研究可仅用一个种属。

给药方案：给药途径和方案应模拟临床拟用方式。如可行，应包含TK/PK评估。

研究持续时间：应基于临床拟用疗程和适应症确定。短期使用（如7天）或用于急性危重疾病的生物药：2周重复给药研究通常足够支持临床试验及上市；慢性适应症：长期毒性研究需科学论证，6个月研究通常被监管机构接受，但根据情况可更短或更长。

恢复期设置：研究应包含无药恢复期，以评估毒性是否可逆、恶化或出现延迟毒性；若药物引起持久药理/毒性效应，应持续监测恢复期动物直至确认可逆性。

抗药抗体（ADA）的影响：生物药常诱导动物产生抗药抗体（ADA），可能影响药效、PK/PD及毒性表现；所有重复给药毒性研究均应检测总抗体和中和抗体，采样时间点包括给药前、给药期间、末次给药后剖检时、恢复期末（存活动物）。ADA的存在本身不构成提前终止或修改研究的理由，除非其干扰了毒性、PK或PD数据的解读。

剂量选择原则：基于体外/体内初步活性数据及药理模型中的有效剂量；考虑预测的人体等效剂量；研究通常应能确定NOAEL（肿瘤药物除外），并包含一个明显毒性剂量；最高剂量的暴露量应至少为预期最高临床剂量的10倍。

生物药通常采用静脉或皮下注射，口服给药一般不可行（因胃肠道蛋白酶快速降解），这点与小分子不同。

3.3免疫原性研究

多数人用生物药在动物中具有免疫原性，故重复给药毒性研究中必须检测抗体。根据ICH S6指南，应表征抗体反应（如滴度、阳性动物数、是否中和），并关联药理/毒理变化。

需评估ADA对以下方面的影响：PK/PD参数；不良反应发生率/严重程度；补体激活；新毒性出现；免疫复合物沉积相关的病理改变（如血管炎）。

ADA不应单独作为终止研究的依据，除非显著干扰数据解读。另外，动物中ADA的产生不能预测人体是否产生抗体。人体即使产生抗体（如人源化抗体），也可能不影响药效；

豚鼠过敏试验（如全身过敏反应）对重组蛋白价值有限：结果常为阳性，但不能预测人体反应；人类中严重过敏反应罕见。

ADA可能通过以下机制导致间接毒性：形成免疫复合物，沉积于血管，激活炎症通路（免疫复合物病）；与内源性蛋白交叉反应，中和或干扰其功能，引发毒性。

3.4免疫毒性研究

目的：评估生物治疗药物对免疫系统的不良影响。许多生物药可激活或抑制免疫系统，或间接干扰免疫细胞功能（如抗IGF-1R单抗可抑制胸腺T细胞成熟）；

主要免疫毒性表现：免疫激活→自身免疫病；免疫抑制→抗感染或抗肿瘤能力下降。

常规毒性研究中的免疫评估指标：1）血液学：总白细胞计数、分类计数；2）解剖：脾脏、胸腺等淋巴器官重量；3）组织病理学：脾、胸腺显微结构。这些变化可能提示免疫毒性。

应区分免疫毒性与应激反应：高剂量（接近最大耐受剂量）可能引起应激（如皮质酮升高），导致中性粒细胞↑、淋巴细胞↓；胸腺重量↓、皮质细胞减少；脾/淋巴结细胞减少；肾上腺重量↑；体重增长减缓、活动减少。需有充分证据证明是应激所致，才能排除直接免疫毒性。

进阶免疫毒性评估：若初步研究提示免疫毒性，应在后续研究中加入特异性终点。免疫表型分析（如流式细胞术/FACS、免疫组化/IHC）可较易整合入常规研究，用于鉴定/计数白细胞亚群，但表型分析非功能性检测，需结合功能试验（如T细胞依赖性抗体反应），功能性免疫毒性试验参考ICH S8指南。

种属选择与数据外推的局限性：应使用药理学相关种属。不同物种免疫系统差异大，可能影响可行性、数据解读及人体相关性。淋巴细胞亚群标志物在小鼠、人、部分非人灵长类中可用，但未必跨种属一致表达。现有标志物尚未被证实能良好预测免疫毒性；即使使用药理相关种属，动物免疫反应仍可能无法准确预测人体反应。建议结合临床数据或人源白细胞体外实验，验证动物发现的人体相关性。

3.5发育与生殖毒性研究

是否开展取决于：药物适应症；目标患者人群（如育龄女性）；产品特性（如作用机制、半衰期等）。

若药物拟用于育龄女性且需重复或长期给药，则应开展相关研究。

评估生物药对哺乳动物从受孕到性成熟全过程的影响，包括：成年动物的生育力；早期胚胎发育；胚胎-胎儿发育；围产期及出生后发育（含母体功能）；潜在的发育免疫毒性（尤其适用于具有长期免疫调节作用的生物药，如单抗），可通过修改研究设计评估新生动物的免疫功能。

开展时机与监管要求：欧盟和日本要求在III期临床前完成。无论如何，注册前必须完成相关研究。

早期临床阶段的重复给药毒性研究可提供男性生育力影响的初步信息。

动物种属选择：应使用药理学相关种属；若在常规种属（如大鼠、兔）中无活性，则非人灵长类（NHP）常是唯一选择。

非人灵长类的局限性：性成熟动物数量有限；个体遗传异质性高（非近交系）；每胎仅产1仔；自发流产率高；妊娠期长达5–7倍于大鼠/兔（约5–6个月）。

建议

胚胎-胎儿发育研究：必要时在NHP中进行，以评估对胚胎的风险。

生育力与早期胚胎发育研究：若组织交叉反应显示药物结合生殖器官，或重复毒性研究提示风险，应在NHP中开展；否则，可在重复给药毒性研究中纳入相关终点替代。

围产期及出生后发育研究：因NHP繁殖周期长、产仔少，通常无法完整开展。当然，并不绝对，国内已有一些NHP开展先例，并走到了BLA阶段。

若为免疫调节剂且需评估子代免疫功能，可在修改版“胚胎-胎儿发育研究”中加入相关终点。

无相关动物种属时的替代方案：可考虑使用转基因小鼠或同源蛋白进行研究。不过，因设计复杂，应提前与监管机构相关部门沟通研究必要性与方案。

3.6遗传毒性研究

标准ICH S2B推荐的遗传毒性试验（检测DNA损伤、突变、染色体畸变）不适用于生物药。原因在于生物药分子量大，无法穿透完整细胞的细胞膜和核膜，不能直接接触DNA。通常无需开展遗传毒性研究。

3.7致癌性研究

一般不要求进行标准啮齿类致癌性生物测定（如2年大鼠/小鼠试验）。

但需根据以下因素评估是否需进行产品特异性致癌风险评估：目标人群；治疗持续时间；生物学活性（如是否为生长因子、免疫调节剂）。

不依赖标准致癌试验，而应整合多源数据：已发表文献（如转基因/敲除动物模型、人类遗传病数据）；同类药物效应；靶点生物学信息；体外数据；慢性毒性研究结果；临床数据。

特殊情况处理：若机制提示可能促进肿瘤生长。可通过长期重复给药毒性研究中的组织病理学、体外细胞增殖实验等进行评价。若现有证据未提示致癌风险→无需啮齿类致癌试验；若存在理论风险但体外/慢性毒性研究未支持，而企业希望避免标签警示，可开展额外研究以消除疑虑。

啮齿类致癌试验或使用同源产品的短期试验通常价值有限，不推荐用于临床候选物评估。

致癌性评估结果用于：说明书风险提示；制定风险管理计划（RMP）；指导临床监测与上市后监测。

某些情况下（如免疫调节剂、生长因子），上市后临床监测比临床前研究更有效。

3.8局部耐受性研究

应在相关动物种属中，使用拟上市制剂，采用与临床相同的给药途径和方案进行。应在首次人体给药前完成。

可整合进其他毒性研究中，无需单独开展（若单次/重复给药研究已能评估局部反应）。

局部刺激的可能原因：T细胞活化相关病理；免疫复合物沉积；对处方辅料的超敏或刺激反应；注射针头造成的机械损伤。

评估方法：推荐在毒理研究中对注射部位进行组织病理学检查；

注意：人源蛋白在动物中反复注射可能引起严重局部反应，但该反应在人体中未必发生，解读时需谨慎。

3.9可比性研究（Comparability Studies）

生物药在临床开发及上市后常发生工艺变更。临床前研究用样品无需与临床/上市样品完全相同，但需证明可比性。

可比性评估内容：理化特性表征；体外功能活性比较（如结合力、效价、信号通路激活等）。确认变更不影响产品的身份、安全性、纯度或有效性。

“可比”的判定标准：若理化、生物活性、免疫化学性质高度相似→可比；即使存在微小理化差异，但不影响安全性和有效性→仍可视为可比。

若判定“不可比”：需评估变更前样品的非临床数据是否仍可用于支持变更后产品的临床开发或注册。

补充研究（桥接研究）：若质量属性数据不足以证明可比性，可考虑在合适动物模型中开展桥接研究。PK桥接研究最常见，在药理相关种属中直接比较变更前后产品的PK参数；所选动物的PK特征应尽可能接近人体（如有临床PK数据可供比对）。

何时需要额外动物研究？

当存在以下情况时，可能需补充PD或毒性桥接研究：变更前产品有特殊安全性特征；工艺变更幅度大；发现产品在纯度、结构或体外活性方面存在差异。

建议：申办方应提前与监管机构沟通桥接研究计划，确保研究设计充分支持可比性结论。

新分子实体和生物制品支持临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期所需的非临床研究内容汇总如下：

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